本文選題：長鏈非編碼RNA + lincRNA　； 參考：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2017年碩士論文

【摘要】：研究背景及目的肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是我國臨床上比較常見的惡性程度比較高的一種的惡性腫瘤,根據(jù)權(quán)威資料顯示,在全世界范圍內(nèi),肝癌患者的死亡病例大概為每年70萬例左右,同時肝癌患者的新增病例為每年74萬左右,這些死亡和新增的肝癌患者中大約有50%的病例都發(fā)生在我們中國。由于肝癌具有高發(fā)病率和死亡率,肝癌已經(jīng)引起世界范圍科學(xué)研究領(lǐng)域的重視,而且我們中國的肝癌發(fā)病率及死亡率也是呈現(xiàn)逐年上升的趨勢,肝癌的死亡率目前在各種惡性腫瘤的相關(guān)死亡原因中排名都比較靠前,目前排在第2位,對我們?nèi)祟惖纳眢w和心理健康都構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅,由此可見,肝癌目前已經(jīng)成為了一個全世界范圍內(nèi)相當(dāng)嚴(yán)峻的社會公共衛(wèi)生問題。肝癌的發(fā)生以及其發(fā)展的生物學(xué)過程是一個相當(dāng)復(fù)雜的過程。因此,我們需要深入HCC發(fā)生發(fā)展過程中的分子生物學(xué)機(jī)制,并探尋HCC發(fā)病預(yù)測、早期診斷和靶向治療的新策略,從而達(dá)到有效地改善肝癌患者的治療預(yù)后、延長肝癌患者生存時間的目標(biāo)。如今,二代測序技術(shù)的發(fā)展速度相當(dāng)?shù)难该?曾經(jīng)一直被科學(xué)家們認(rèn)為是基因組里面的“噪音”的非編碼RNA,通過近些年以來的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),這些非編碼RNA在人體的整個生命活動中發(fā)揮著十分重要的作用,所以非編碼RNA目前已經(jīng)在生命科學(xué)領(lǐng)域中迅速地成為了主要的研究熱點之一。基因間長鏈非編碼RNA(long intergenic non-coding RNA,lincRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本的長度在200-10000nt之間、不編碼蛋白,但是能參與細(xì)胞內(nèi)多種過程調(diào)控的RNA,這些長鏈非編碼RNA的種類、數(shù)量、功能都不十分明確,其可以通過多種方式調(diào)控基因表達(dá),包括與微小RNA(microRNA,miRNA)相互作用、與蛋白質(zhì)等相互作用、剪切調(diào)控、外源性沉默以及遺傳變異等多個方面,尤其是lincRNA可以在多個水平調(diào)控基因的表達(dá)。雖然近期通過有關(guān)的實驗研究并結(jié)合相關(guān)的理論知識,都可以表明lincRNA在多種惡性腫瘤中都有著特定的調(diào)節(jié)和控制的相關(guān)機(jī)制,但是目前人們關(guān)于非編碼轉(zhuǎn)錄本的有關(guān)研究尚處于起步的階段,絕大部分的lincRNA都未曾被偉大的人類進(jìn)行具體和深入的研究。盡管最近有關(guān)報道LncRNA HULC,CCAT1等在肝癌中發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著十分重要作用,但大部分的lincRNA在肝癌中的發(fā)生和發(fā)展的臨床意義以及相關(guān)的作用機(jī)制仍不是特別的清楚。所以,具體而深入的研究lincRNA的在肝癌中的相關(guān)作用機(jī)制及有關(guān)功能,將有可能成為肝癌患者的早期診斷和積極治療,并取得良好治療效果的新方向。本研究基于人類LncRNA公共數(shù)據(jù)庫GSE55191和GSE580435,由此我們發(fā)現(xiàn)了基因間長鏈非編碼RNA 524346(long non-coding RNA 524346,lincRNA524346)在肝細(xì)胞癌患者的癌組織中的表達(dá)水平相比較于癌旁組織和正常肝組織中降低比較明顯。但是,lincRNA 524346在肝癌組織中的低表達(dá)是否表明著其可能具有重大的功能意義,需要我們進(jìn)行進(jìn)一步地深入研究。本論文的主要研究目的正是檢測肝癌中的lincRNA 524346的表達(dá)情況及其相關(guān)的臨床意義。首先運用qRT-PCR的具體方法對lincRNA 524346在61對行手術(shù)切除的肝癌患者(癌、癌旁)組織標(biāo)本、肝癌細(xì)胞系SMMC-7721,HepG2和Huh7及肝臟正常細(xì)胞系LO2中的表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)檢測,接著將lincRNA524346的相關(guān)表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌患者的臨床病理特征間的相關(guān)性進(jìn)行具體的統(tǒng)計分析。用受試者工作曲線(receiver operating characteristics,ROC)來評價肝癌患者的肝癌組織中l(wèi)incRNA 524346的相關(guān)表達(dá)水平在肝細(xì)胞癌的早期診斷中的效能。最后,結(jié)合lincRNA 524346的表達(dá)情況與肝癌患者的無復(fù)發(fā)生存時間的關(guān)系,明確lincRNA 524346是否對肝癌患者的預(yù)后有一定的提示作用。一、材料與方法1、臨床組織樣本收集和細(xì)胞系本研究共納入了61位肝細(xì)胞癌患者,61對新鮮肝癌組織(癌、癌旁)標(biāo)本來自2013年12月至2015年12月期間在我院進(jìn)行第一次肝癌手術(shù)R0切除的患者,手術(shù)標(biāo)本在離體后迅速保存在液氮中。所有入組患者的標(biāo)本在收集前均未進(jìn)行包括TACE和手術(shù)等在內(nèi)的任何抗腫瘤治療,術(shù)后標(biāo)本經(jīng)我院的病理醫(yī)生明確證實為肝細(xì)胞癌。取來自于與肝癌患者癌組織配對的癌旁組織(距離手術(shù)切緣至少3cm)作為對照組標(biāo)本,這些標(biāo)本的術(shù)后病理檢查都未發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞。研究中對納入本研究的肝癌組織的樣本進(jìn)行隨機(jī)選擇,并對這些患者進(jìn)行1年以上的隨訪。依據(jù)Edmondson-Steiner的有關(guān)分級標(biāo)準(zhǔn)來確定腫瘤的具體分化程度,按照美國腫瘤研究聯(lián)合委員會(American Joint Committee on Cancer,AJCC)2010發(fā)布的第七版分期系統(tǒng)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)來確定腫瘤的具體分期。肝癌細(xì)胞系SMMC-7721、HepG2和Huh7以及正常肝細(xì)胞系LO2,由中國人民解放軍第三0二醫(yī)院臨床管理中心提供,均使用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基作為培養(yǎng)基,置于37℃5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2、RNA提取,逆轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量PCR運用Trizol(LifeTechnologies,USA)法提取組織樣本及各種細(xì)胞系中的總RNA,然后將RNA反轉(zhuǎn)錄成為cDNA。接著使用StepOnePlusTM實時熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行實時熒光定量PCR對反轉(zhuǎn)錄后的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)內(nèi)參基因為GAPDH。使用2-△△Ct相對定量方法來分析和計算相應(yīng)的倍數(shù)變化。3、統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件來對相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。非參數(shù)Wilcoxon秩和檢驗對lincRNA524346在配對癌旁組織、癌組織以及細(xì)胞系的相關(guān)表達(dá)水平進(jìn)行有效的比較,lincRNA524346在肝癌細(xì)胞系及正常的LO2細(xì)胞中的相關(guān)表達(dá)差異采用t檢驗。ROC曲線來評價lincRNA524346在診斷肝細(xì)胞癌中的特異度和敏感度,同時使用ROC曲線下面積(AUC)來評價lincRNA 524346在肝細(xì)胞癌中的診斷能力;以95%為可信區(qū)間。最后利用Kaplan-Meier對肝癌患者的預(yù)后進(jìn)行分析(包括無復(fù)發(fā)生存等),P0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。二、結(jié)果2.1、lincRNA 524346在肝細(xì)胞癌患者(癌、癌旁)組織及肝癌細(xì)胞系的表達(dá)水平及ROC分析通過qRT-PCR的方法來分別檢測61例肝細(xì)胞癌患者癌組織及其配對癌旁組織中l(wèi)incRNA 524346的表達(dá)水平,結(jié)果表明lincRNA 524346在83.6%(51/61)肝細(xì)胞癌患者的肝癌組織中的表達(dá)水平較癌旁組織中的表達(dá)明顯下調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。其ROC曲線下面積(AUC)為0.74(95%CI:0.6435~0.8429,P0.0001),大于0.7,表示預(yù)測價值中等,其cut off值是0.009時,敏感性為65.12%、特異性為63.83%、約登指數(shù)為0.29,初步提示lincRNA524346在肝細(xì)胞癌的診斷中具有一定的價值。3種肝癌細(xì)胞系與正常肝細(xì)胞株LO2相比,lincRNA 524346均為低表達(dá),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01);其中在SMMC-7721細(xì)胞中表達(dá)水平最低。2.2、lincRNA 524346表達(dá)與HCC患者臨床病理特征、預(yù)后的相關(guān)性分析通過對61位肝癌患者中l(wèi)incRNA 524346的表達(dá)情況與其對應(yīng)的臨床病理特征信息進(jìn)行相關(guān)分析,我們發(fā)現(xiàn):lincRNA 524346的表達(dá)與病理分期、腫瘤數(shù)目、PVTT、肝硬化和微靜脈浸潤明顯相關(guān),然而與年齡、腫瘤的大小、性別、組織分化水平、血清AFP水平、飲酒以及吸煙沒有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異。同時我們對61位肝癌患者中l(wèi)incRNA 524346的表達(dá)和肝癌患者術(shù)后的復(fù)發(fā)時間的關(guān)系分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn):lincRNA 524346的表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌患者行肝癌切除手術(shù)后的無復(fù)發(fā)生存時間有明顯的關(guān)系。三、結(jié)論1、lincRNA 524346在肝細(xì)胞癌患者癌組織中的表達(dá)較配對癌旁組織相比,呈現(xiàn)顯著低表達(dá)。2、lincRNA 524346在肝癌細(xì)胞系(SMMC-7721、HepG2和Huh7)中的表達(dá)較正常肝細(xì)胞系LO2相比為顯著低表達(dá)。3、lincRNA 524346的表達(dá)水平與肝癌患者的腫瘤數(shù)目、PVTT、病理分期、肝硬化及微靜脈浸潤具有顯著相關(guān)性。4、lincRNA 524346低表達(dá)的肝癌患者較高表達(dá)患者的預(yù)后差。5、lincRNA 524346可作為肝癌患者預(yù)后的影響因素。
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【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7
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本文編號：1764454