本文選題：DEC2 + 胃癌　； 參考：《山東大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：研究背景胃癌是我國常見的消化道惡性腫瘤,侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤生物學(xué)行為的具體反映,研究胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的精細(xì)調(diào)控機制,尋找、發(fā)現(xiàn)、和鑒定這個過程中的關(guān)鍵調(diào)控分子,對臨床腫瘤的預(yù)防與治療具有迫切的現(xiàn)實意義。多種轉(zhuǎn)錄因子和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的激活以及腫瘤相關(guān)基因的差異表達(dá),均可影響腫瘤的惡性進程,其中,轉(zhuǎn)錄因子對下游基因的表達(dá)調(diào)控作用是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵。探索轉(zhuǎn)錄因子在腫瘤中的具體表達(dá)調(diào)控模式,可為腫瘤生物治療提供新的干預(yù)靶點和預(yù)測指標(biāo)。轉(zhuǎn)錄因子DEC2是一個生長發(fā)育基因,具有堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)結(jié)構(gòu),之前DEC2的功能研究多集中在DEC2對生物節(jié)律、生長發(fā)育及免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)中,最近報道了 DEC2以組織細(xì)胞特異性的方式參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞惡性進程,研究發(fā)現(xiàn),DEC2在胰腺癌腫瘤組織中表達(dá)低于癌旁正常組織,而在子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)高于癌旁正常組織。DEC2發(fā)揮作用主要體現(xiàn)在增殖凋亡調(diào)控和腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化調(diào)控。一方面,DEC2對腫瘤細(xì)胞增殖凋亡具有雙重調(diào)節(jié)作用:DEC2通過下調(diào)cyclin D1表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞增殖;另一篇關(guān)于乳腺癌的研究報道稱,利用siRNA沉默乳腺癌細(xì)胞MCF-7中DEC2基因表達(dá)后,凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加,進一步實驗發(fā)現(xiàn)DEC2可調(diào)控Caspase8、Fas等基因的表達(dá),通過死亡受體途徑發(fā)揮抗凋亡效應(yīng);另外,在口腔癌細(xì)胞HSC-3中,DEC2通過抑制促凋亡因子Bim的表達(dá)發(fā)揮抗凋亡效應(yīng)。另一方面,DEC2對腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移具有雙重調(diào)節(jié)作用:在乳腺癌中,DEC2結(jié)合到缺氧誘導(dǎo)因子(HIFs)啟動子上抑制其表達(dá),從而抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移;另外,通過與SP1競爭性結(jié)合TWIST1啟動子區(qū)的SP1結(jié)合位點,DEC2可抑制子宮內(nèi)膜癌發(fā)生EMT相關(guān)的腫瘤轉(zhuǎn)移;在胰腺癌細(xì)胞BxPC-3中,DEC2通過調(diào)控SLUG抑制TGF-β 1誘導(dǎo)的EMT過程;關(guān)于頭頸癌一項研究稱,DEC2參與喚醒骨髓中的沉睡播散腫瘤細(xì)胞(DTCs)發(fā)生多器官轉(zhuǎn)移。綜上我們發(fā)現(xiàn),DEC2在腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮促癌或抑癌作用尚無定論。深入研究DEC2在胃癌惡性進程中的作用及分子機制是本研究擬解決的關(guān)鍵問題。研究目的為明確DEC2在胃癌惡性進程中的作用,我們通過免疫組織化學(xué)染色法檢測胃癌組織和癌旁正常胃組織樣品中DEC2的表達(dá),并分析胃癌組織中DEC2表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)及病人生存預(yù)后的相關(guān)性,探討其潛在的臨床價值;然后通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和慢病毒感染技術(shù),獲得過表達(dá)或干擾DEC2的胃癌細(xì)胞株,檢測DEC2對胃癌細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為的影響;并進行下游基因和分子通路的篩選驗證,進一步揭示DEC2發(fā)揮腫瘤調(diào)控作用的分子機制,為探索DEC2可否作為胃癌治療的新靶點提供初步理論基礎(chǔ)。研究方法1.免疫組織化學(xué)染色法檢測DEC2在胃癌組織及癌旁正常胃組織中的表達(dá)水平,依據(jù)免疫組化染色評分標(biāo)準(zhǔn),統(tǒng)計分析組織樣本中DEC2表達(dá)水平與胃癌患者臨床病例參數(shù)之間的關(guān)系及其與E-cadherin表達(dá)的相關(guān)性;收集胃癌患者的預(yù)后隨訪資料,采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線,應(yīng)用Log-rank檢驗統(tǒng)計DEC2和E-cadherin的表達(dá)水平與胃癌患者生存期之間的關(guān)系。2.qPCR 和 Western blot 法檢測 DEC2 在胃癌細(xì)胞株(HGC27、MGC803、BGC823、MKN-45)及永生化胃上皮細(xì)胞株(GES-1)中的表達(dá)水平,同時篩選出高表達(dá)和低表達(dá)DEC2的胃癌細(xì)胞株。選擇低表達(dá)DEC2的胃癌細(xì)胞株MGC803和MKN-45,通過慢病毒感染建立穩(wěn)定過表達(dá)DEC2的細(xì)胞株;選擇相對高表達(dá)DEC2的胃癌細(xì)胞株HGC27,通過慢病毒感染建立穩(wěn)定干擾DEC2的細(xì)胞株。3.CCK8和EdU實驗檢測DEC2對胃癌細(xì)胞增殖能力的影響;Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測DEC2對胃癌細(xì)胞凋亡能力的影響;劃痕和Transwell侵襲和遷移實驗檢測DEC2對胃癌細(xì)胞侵襲遷移能力的影響。4.選擇SPF級BALB/cNude裸鼠,分別采用皮下注射和經(jīng)尾靜脈注射兩種方式,將穩(wěn)定過表達(dá)DEC2的胃癌細(xì)胞株DEC2/MKN-45、穩(wěn)定干擾DEC2的胃癌細(xì)胞株DEC2-sh/HGC27及各對照組胃癌細(xì)胞株注入裸鼠體內(nèi)。觀察DEC2對胃癌細(xì)胞體內(nèi)增殖和轉(zhuǎn)移能力的影響。5.鏡下觀察DEC2對胃癌細(xì)胞形態(tài)的影響,Western blot和細(xì)胞免疫熒光染色法檢測DEC2對上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)指標(biāo)蛋白(N-cadherin、Vimentin、E-cadherin)的調(diào)節(jié)作用。6.Western blot法檢測DEC2對ERK/NF-κB通路相關(guān)靶蛋白表達(dá)水平的影響;通過加入ERK信號通路阻斷劑,觀察DEC2調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和細(xì)胞侵襲遷移能力的變化。研究結(jié)果1.DEC2在胃癌組織中低表達(dá)且與胃癌患者不良預(yù)后相關(guān)DEC2在癌旁正常組織和胃癌組織中的陽性表達(dá)率分別為67.35%和22.45%(p0.05),并且DEC2的表達(dá)與腫瘤浸潤(p=0.001)、淋巴管轉(zhuǎn)移(p=0.033)及TNM分期(p=0.001)呈顯著負(fù)相關(guān);DEC2在胃癌組織中的表達(dá)與E-cadherin的表達(dá)正相關(guān)(r=0.563,p0.001);高表達(dá)DEC2和E-cadherin組患者五年生存期顯著高于低表達(dá) DEC2 和 E-cadherin 組(p=0.003)。2.DEC2抑制胃癌細(xì)胞體外增殖及侵襲遷移qPCR和Western blot法檢測結(jié)果顯示,DEC2在永生化胃上皮細(xì)胞株GES-1中的表達(dá)水平顯著高于胃癌細(xì)胞株(HGC27、MGC803、BGC823、MKN-45)。DEC2本底表達(dá)量最低的胃癌細(xì)胞株MGC803和MKN-45過表達(dá)DEC2后,其增殖和侵襲遷移能力明顯受到抑制,而凋亡細(xì)胞比例增加;DEC2本底表達(dá)量相對較高的胃癌細(xì)胞株HGC27干擾DEC2表達(dá)后,其增殖和侵襲遷移能力明顯增強,而凋亡細(xì)胞比例減少。3.DEC2抑制胃癌細(xì)胞體內(nèi)成瘤及轉(zhuǎn)移裸鼠皮下成瘤模型發(fā)現(xiàn)DEC2顯著抑制胃癌細(xì)胞成瘤及瘤體生長:過表達(dá)DEC2后,腫瘤生長速度明顯慢于對照組,瘤重小于對照組;干擾DEC2表達(dá)后,腫瘤生長速度明顯快于對照組,瘤重大于對照組。裸鼠經(jīng)尾靜脈注射轉(zhuǎn)移模型發(fā)現(xiàn)DEC2抑制胃癌細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移:造模6周后取裸鼠肺組織,計數(shù)其表面腫瘤轉(zhuǎn)移灶,HE染色后觀察其病理形態(tài)。結(jié)果顯示,過表達(dá)DEC2組裸鼠肺組織轉(zhuǎn)移灶明顯少于對照組;干擾DEC2組裸鼠肺組織轉(zhuǎn)移灶明顯多于對照組。4.DEC2抑制胃癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)鏡下觀察發(fā)現(xiàn),過表達(dá)DEC2后,胃癌細(xì)胞株DEC2/MGC803和DEC2/MKN-45形態(tài)趨于卵石狀;然而,干擾DEC2表達(dá)后,胃癌細(xì)胞株DEC2-sh/HGC27形態(tài)無明顯變化。Western blot和細(xì)胞免疫熒光染色法檢測結(jié)果顯示:過表達(dá)DEC2后,DEC2/MGC803和DEC2/MKN-45細(xì)胞間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin的表達(dá)水平明顯減低,而上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)水平明顯升高;干擾DEC2表達(dá)后,DEC2-sh/HGC27細(xì)胞間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin的表達(dá)水平明顯升高,而上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)水平明顯降低。5.DEC2通過阻斷ERK/NF-κB通路抑制胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT相關(guān)的侵襲轉(zhuǎn)移Western blot檢測結(jié)果顯示:過表達(dá)DEC2后,DEC2/MGC803和DEC2/MKN-45細(xì)胞中ERK和NF-κB p65的磷酸化水平明顯降低,而E-cadherin的表達(dá)水平明顯升高;干擾DEC2表達(dá)后,DEC2-sh/HGC27細(xì)胞中ERK和NF-κB p65的磷酸化水平明顯升高,而E-cadherin的表達(dá)水平降低。加入ERK通路抑制劑 U0126 后,在胃癌細(xì)胞株 DEC2/MGC803、DEC2/MKN-45 中,NF-κBp65的磷酸化水平以及其侵襲遷移能力進一步受到抑制,而E-cadherin的表達(dá)水平進一步升高。而在DEC2-sh/HGC27細(xì)胞中,U0126部分抵消了下調(diào)DEC2引起的NF-κB p65的磷酸化水平、侵襲遷移能力的升高和E-cadherin的表達(dá)水平的降低。研究結(jié)論1.首次發(fā)現(xiàn)DEC2在胃癌組織中低表達(dá)且與胃癌患者不良預(yù)后相關(guān)。2.體內(nèi)體外實驗證實DEC2可抑制胃癌細(xì)胞增殖、侵襲遷移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)等多種惡性生物學(xué)行為。3.DEC2通過阻斷胃癌細(xì)胞中ERK/NF-κB信號通路上調(diào)E-cadherin表達(dá),進而調(diào)控胃癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT),最終抑制胃癌轉(zhuǎn)移。
[Abstract]:On the other hand , DEC2 has a double regulatory effect on tumor cell proliferation . In addition , DEC2 plays an important role in the regulation of tumor cell proliferation by downregulating the expression of apoptosis factor Bim . In addition , DEC2 plays a dual role in regulating tumor cell proliferation . In addition , DEC2 plays an important role in inhibiting tumor cell proliferation . The effects of DEC2 on gastric cancer cell proliferation , proliferation , apoptosis and invasion and metastasis of gastric cancer cells were determined by means of plasmid transfection and slow virus infection . The expression level of DEC2 in gastric epithelial cell line GES - 1 was significantly higher than that in gastric cancer cell line ( HGC27 , MGC803 , BGC823 , MKN - 45 ) . The proliferation and invasion and migration ability of gastric cancer cell lines MGC803 and MKN - 45 were significantly inhibited after DEC2 expression . The expression levels of ERK and NF - 魏B p65 in DEC2 / MGC803 and DEC2 / MKN - 45 cells were significantly lower than those in control group . 3 . DEC2 regulates the expression of E - cadherin by blocking ERK / NF - 魏B signaling pathway in gastric cancer cells , thus regulating the epithelial mesenchymal transition ( EMT ) of gastric cancer cells , and finally inhibiting gastric cancer metastasis .

【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.2

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本文編號：1761230