本文選題：肺癌 + miRNA　； 參考：《東南大學》2017年博士論文

【摘要】：研究背景與目的肺癌是最致命的惡性腫瘤之一,在中國其發(fā)病率和死亡率均位于首位,嚴重威脅人們的生命健康和生活質(zhì)量,是我國的重大公共衛(wèi)生問題之一。探索肺癌的發(fā)病機理,尋找有效的肺癌篩查和早期診斷的生物標志物,是降低肺癌發(fā)病率和死亡率的關鍵。本研究通過miRNA及l(fā)ncRNA芯片高通量篩選技術,結合TCGA大數(shù)據(jù)庫及生物信息學分析遴選肺癌相關候選生物標志物;并進一步擴大人群樣本量,應用實時熒光定量PCR技術檢測并分析miRNA和lncRNA對肺癌發(fā)病風險的影響及其診斷價值;最后選取miR-30a-3p、miR-30a-5p及BRE-AS1進一步探索其在肺癌細胞中的生物學功能及可能的調(diào)控機制,為進一步了解肺癌的發(fā)病機制、篩選肺癌診斷、治療生物標志物提供理論依據(jù)。研究方法1.應用miRNA表達譜芯片技術篩選肺癌組織及癌旁組織中差異表達miRNA,結合TCGA大數(shù)據(jù)庫及生物信息學分析構建miRNA-mRNA表達網(wǎng)絡,進一步遴選出肺癌相關miRNA。采用RT-qPCR技術在肺癌人群中對篩選出的差異表達miRNA進行檢測,logistic回歸分析其異常表達與肺癌發(fā)病風險之間的關系,應用ROC曲線下面積評估候選miRNA在肺癌中的診斷價值,采用獨立樣本t檢驗分析候選miRNA表達水平與肺癌臨床特征之間關系。2.應用lncRNA表達譜芯片技術篩選差異表達lncRNA,結合TCGA大數(shù)據(jù)庫及生物信息學分析構建lncRNA-mRNA表達網(wǎng)絡,進一步遴選出肺癌相關lncRNA。在肺癌人群中采用RT-qPCR技術對篩選出的差異表達lncRNA進行檢測,logistic回歸分析其異常表達與肺癌發(fā)病風險之間的關系,應用ROC曲線下面積評估候選lncRNA在肺癌中的診斷價值,采用獨立樣本t檢驗分析候選lncRNA表達水平與肺癌臨床特征之間關系。3.利用 miR-30a-3pmimic 和 miR-30a-5pmimic 分別轉(zhuǎn)染 A549 肺癌細胞,構建 miR-30a-3p 和miR-30a-5p過表達細胞模型,應用RT-qPCR技術檢測轉(zhuǎn)染后A549細胞中miR-30a-3p和miR-30a-5p表達情況,確定轉(zhuǎn)染效率。在此基礎上進一步分析過表達miR-30a-3p和miR-30a-5p后對肺癌細胞生物學功能的影響及可能調(diào)控機制,包括MTT法檢測細胞生長增殖、流式細胞術檢測細胞周期、Annexin-V FITC PI雙染法檢測細胞凋亡。Western Blot檢測PI3K-AKT-mTOR通路中關鍵蛋白水平的表達。4.構建lncRNA BRE-AS1慢病毒過表達載體,轉(zhuǎn)染A549肺癌細胞構建BRE-AS1過表達穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞模型,應用RT-qPCR技術檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)后A549細胞中BRE-AS1的表達情況,確定慢病毒轉(zhuǎn)染效率。進一步在此基礎上分析過表達BRE-AS1對肺癌細胞的生物學功能的影響及可能調(diào)控機制,包括MTT法檢測細胞增殖、流式細胞術檢測細胞周期、Annexin-VAPC7-ADD雙染法檢測細胞凋亡、細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力。Western Blot檢測PI3K-AKT-mTOR通路中關鍵蛋白水平的表達。研究結果1肺癌相關microRNA的識別1.1肺癌microRNA差異表達譜分析miRNA/mRNA表達譜芯片初步篩選出116個miRNA和502個mRNA表達發(fā)生改變。從TCGA數(shù)據(jù)庫篩選出154個差異表達miRNA及5322個差異表達mRNA。二者綜合分析,得到交集 miRNA/mRNA 有 29 個及 417 個。應用 starbase V2.0 數(shù)據(jù)庫,TargetScan 及 miRTarbase預測miRNA靶基因,所得結果與芯片及TCGA交集417個mRNA構建miRNA-mRNA表達網(wǎng)絡圖。應用DIANA-mirPathV.3對29個潛在肺癌相關miRNA進行通路分析,發(fā)現(xiàn)這些miRNA 所調(diào)控靶基因主要參與 Hippo、TGF-beta、Wnt、ErbB、MAPKsignalingpathway 等環(huán)境信息過程信號通路及非小細胞肺癌等人類疾病通路。1.2候選microRNA表達水平與肺癌發(fā)病風險及臨床特征關系的研究通過RT-qPCR技術在91例人群組織樣本中檢測6個候選miRNA表達情況,結果顯示miR-205-5p 表達顯著上調(diào),miR-27a-5p、miR-30a-3p、miR-30a-5p、miR-30c-2-3p 和 miR-30d-5p表達顯著下調(diào)(p0.001),與芯片及TCGA數(shù)據(jù)庫所得結果一致。Logistic回歸分析顯示,miR-205-5p表達水平與肺癌發(fā)病風險正相關,增加其表達水平可升高肺癌的發(fā)病風險(OR值為 1.287,p0.01) ; miR-27a-5p、miR-30a-3p、miR-30a-5p、miR-30c-2-3p 和 miR-30d-5p 的表達水平與肺癌發(fā)病風險負相關,增加其表達水平可降低肺癌發(fā)病風險(OR值分別為0.846、0.700、0.585、0.745、0.479, P0.01)。ROC 特征曲線分析結果顯示,miR-205-5p、miR-27a-5p、miR-30a-3p、miR-30a-5p、miR-30c-2-3p、miR-30d-5p 單獨診斷 AUC 分別是 0.728、0.637、0.758、0.772、0.734、0.776 (p0.001),聯(lián)合診斷 AUC 為 0.898(p0. 001),聯(lián)合診斷敏感度和特異度分別為87.7%和84.9%,提示這些miRNA對肺癌有一定診斷效力、聯(lián)合診斷效果更佳。獨立樣本 t 檢驗分析結果發(fā)現(xiàn),miR-205-5p、miR-30a-3p、miR-30c-2-3p、miR-30d-5p異常表達水平與肺癌患者病理分型有關(p0.05),其表達差異在肺鱗癌中顯著高于肺腺癌。miR-30a-3p、miR-30c-2-3p異常表達水平與肺癌患者性別有關(p0.05),其表達差異在男性中顯著高于女性。miR-30a-5p、miR-30c-2-3p異常表達水平與肺癌患者的年齡相關(p0.05),其表達差異在大于50歲患者中顯著高于小于50歲患者。提示在不同肺癌病理分型、年齡及性別群體中,miRNA的表達差異不盡相同,即在特定人群中研究miRNA的表達可能對肺癌的診斷、治療及預后更有意義。2肺癌相關lncRNA的識別2.1肺癌lncRNA差異表達譜分析利用lncRNA表達譜芯片篩選出385個肺癌相關差異表達lncRNA,其中124個表達上調(diào),261個表達下調(diào)。從TCGA數(shù)據(jù)庫中篩選出337個肺癌相關差異表達lncRNA,其中191個表達上調(diào),146個表達下調(diào)。二者綜合分析得11個交集lncRNA,其中表達下調(diào)lncRNA有3 個,即 MCTS2P、SCARNA12 與 LOC728554,表達上調(diào)lncRNA 有 8 個,即 LHFPL3-AS2、SFTA1P、LINC00472、GVINP1、BRE-AS1、MIR22HG、LINC00312、MEIS3P1�；� 11 個候選lncRNA及417個mRNA構建表達網(wǎng)絡圖。2.2候選lncRNA表達水平與肺癌發(fā)病風險及臨床特征關系的研究通過RT-qPCR技術在91例肺癌人群組織中檢測2個候選lncRNA表達情況,結果顯示LINC00312、BRE-AS1均表達下調(diào)(p0.05),與芯片篩選結果及TCGA所得結果一致。Logistic回歸分析顯示,LINC00312和BRE-AS1表達水平與肺癌發(fā)病風險負相關,增加其表達水平可降低肺癌發(fā)病風險(OR值分別為0.739和0.362,p0. 001)。ROC曲線分析結果顯示,LINC00312和BRE-AS1單獨診斷AUC分別是0.784和0.916 (p0.05),兩者聯(lián)合診斷AUC為0.922 (p0.05),兩者聯(lián)合診斷敏感度和特異度分別為87.8%和84.6%,提示聯(lián)合診斷可提高肺癌診斷效能。獨立樣本t檢驗分析結果發(fā)現(xiàn),LINC00312異常表達水平與肺癌患者性別、年齡有關(p0.05),其表達差異在大于50歲男性患者中顯著高于小于50歲女性患者。BRE-AS1異常表達水平與肺癌患者性別、年齡及病理類型有關(P0.05),其表達差異在大于50歲的男性肺鱗癌患者中顯著高于小于50歲的女性肺腺癌患者。提示在不同肺癌病理分型、年齡及性別群體中,lncRNA的表達差異不盡相同,即在特定人群中研究lncRNA的表達可能對肺癌的診斷、治療及預后更有意義。3 MiR-30a-3p和miR-30a-5p在肺癌中的生物學功能及機制研究3.1 MiR-30a-3p和miR-30a-5p的生物信息學分析應用DIANA-mirPath 3.0對miR-30a-3p和miR-30a-5p進行生物信息學分析發(fā)現(xiàn),二者與多個腫瘤如Non small cell lung cancer等發(fā)生發(fā)展密切相關,還參與如PI3K-Akt signaling pathway、Foxo signaling pathway、p53 signaling pathway 等多個腫瘤相關通路的調(diào)控。此外,通過 miR-30a-3p 和 miR-30a-5p 潛在靶基因在 Small cell lung cancer 和 Non small cell lung cancer通路上的作用位點,進一步分析發(fā)現(xiàn)miR-30a-3p和miR-30a-5p可能通過對PI3K-Akt通路中相關蛋白的調(diào)控,進而影響細胞的增殖和凋亡等生物學過程。3.2 MiR-30a-3p和miR-30a-5p對A549細胞的生物學功能研究miR-30a-3p和miR-30a-5p細胞本底值的RT-qPCR檢測結果顯示,與16HBE細胞相比,A549細胞中miR-30a-3p和miR-30a-5p均呈低表達狀態(tài)。與陰性對照組相比,mimic轉(zhuǎn)染組中miR-30a-3p和miR-30a-5p表達水平均顯著升高(p0.05)。MTT法檢測細胞增殖結果顯示,miR-30a-3p和miR-30a-5pmimic轉(zhuǎn)染組中細胞增殖能力在24h、36h、48h均顯著低于陰性對照組(p0.01),提示在A549細胞中過表達miR-30a-3p和miR-30a-5p可抑制細胞生長。細胞周期結果顯示,與陰性對照組相比,miR-30a-3pmimic轉(zhuǎn)染組中細胞S期比例明顯增加(p0.05),提示A549細胞中過表達miR-30a-3p可誘導細胞周期阻滯于S期。細胞凋亡結果顯示,與陰性對照組相比,miR-30a-3p和miR-30a-5p mimic轉(zhuǎn)染組中細胞凋亡率顯著升高(p0.05),提示A549細胞中過表達miR-30a-3p和miR-30a-5p可誘導細胞凋亡增加。3.3 MiR-30a-3p和miR-30a-5p對PI3K-AKT-mTOR信號通路關鍵蛋白的調(diào)控研究對PI3K-AKT-mTOR信號通路關鍵蛋白進行Western Blot檢測,結果顯示,與陰性對照組相比,miR-30a-3pmimic 和 miR-30a-5pmimic 轉(zhuǎn)染組中 AKT3、mTOR、S6K 表達水平明顯下降。提示miR-30a-3p和miR-30a-5p可能通過PI3K-AKT3-mTOR通路影響肺癌的發(fā)生發(fā)展。4 LncRNA BRE-AS1在肺癌中的生物學功能及機制研究4.1慢病毒LncRNABRE-AS1過表達載體構建陽性克隆轉(zhuǎn)化子菌液測序結果與目的基因序列比對分析結果說明測序結果與目標序列完全一致,BRE-AS1過表達慢病毒載體構建成功。4.2 LncRNA BRE-AS1對A549細胞的生物學功能研究慢病毒BRE-AS1過表達轉(zhuǎn)染A549細胞RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn),LV-BRE-AS1組中BRE-AS1表達水平是陰性對照組的59.756倍(p0.05),慢病毒轉(zhuǎn)染效率較好。MTT結果顯示LV-BRE-AS1組細胞生長增殖能力明顯低于陰性對照組(p0.05),提示過表達BRE-AS1可抑制A549細胞增殖能力。細胞周期結果顯示,與陰性對照組相比,LV-BRE-AS1組細胞S期比例減少,G2/M期比例增加,差異具有統(tǒng)計學意義(p0.01),提示過表達BRE-AS1可誘導A549細胞阻滯于G2/M期。細胞凋亡結果顯示,與陰性對照組相比,LV-BRE-AS1組中晚期及總凋亡比例增加,差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05),提示過表達BRE-AS1可誘導A549細胞凋亡升高。細胞劃痕實驗結果顯示,經(jīng)慢病毒BRE-AS1過表達穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后肺癌A549細胞遷移能力與陰性對照比較略呈降低趨勢,但無統(tǒng)計學意義(p0.05)。4.3 LncRNA BRE-AS1對PI3K-AKT-mTOR信號通路關鍵蛋白的調(diào)控研究對PI3K-AKT-mTOR信號通路關鍵蛋白進行Western Blot檢測,結果顯示,與陰性對照組相比,LV-BRE-AS1組中PI3K、AKT3、mTOR、S6K及BCL-XL蛋白表達水平明顯降低。提示BRE-AS1可能通過對PI3K-AKT3-mTOR信號通路關鍵蛋白的表達影響參與肺癌的發(fā)生發(fā)展。研究結論1.本研究通過miRNA芯片、TCGA數(shù)據(jù)庫及miRNA-mRNA表達網(wǎng)絡分析,在肺癌組織中篩選出29個差異表達miRNA。人群樣本檢測發(fā)現(xiàn)miR-205-5p在肺癌組織中高表達,與肺癌發(fā)病風險呈正相關,miR-27a-5p、miR-30a-3p、miR-30a-5p、miR-30c-2-3p、miR-30d-5p 在肺癌組織中低表達,與肺癌發(fā)病風險呈負相關。提示miRNA聯(lián)合分析可提高肺癌的診斷效能,具有較高的應用價值,在不同性別、年齡及病理類型的特定人群中進一步開展肺癌相關miRNA研究可能更具有實際意義。2.本研究通過lncRNA芯片、TCGA數(shù)據(jù)庫及l(fā)ncRNA-mRNA表達網(wǎng)絡分析,在肺癌組織中篩選出 11 個差異表達 LncRNA:MCTS2P、SCARNA12、LOC728554、LHFPL3-AS2、SFTA1P、LINC00472、GVINP1、BRE-AS1、MIR22HG、LINC00312、MEIS3P1。人群樣本檢測首次發(fā)現(xiàn)LINC00312和BRE-AS1在肺癌組織中低表達,與肺癌發(fā)病風險呈負相關。提示lncRNA聯(lián)合分析可提高肺癌的診斷效能,具有較高的應用價值,在不同性別、年齡及病理類型的特定人群中進一步開展肺癌相關lncRNA研究可能更具有實際意義。3.過表達miR-30a-3p和miR-30a-5p可抑制A549細胞增殖、引起細胞S期周期阻滯,誘導細胞凋亡增加。二者可通過對PI3K-AKT-mTOR信號通路中關鍵蛋白的表達影響參與肺癌的調(diào)控。4.本研究首次研究BRE-AS1在肺癌細胞中的生物學功能及機制,過表達BRE-AS1可抑制A549細胞增殖、改變細胞G2/M周期比例、誘導細胞凋亡增加,BRE-AS1可通過對PI3K-AKT-mTOR信號通路中關鍵蛋白的表達影響參與肺癌的發(fā)生發(fā)展。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：東南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R734.2

【參考文獻】

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1 程艷香;陳干濤;楊瀟;洪莉;;LncRNA在子宮脫垂組織中表達譜的變化[J];中國計劃生育和婦產(chǎn)科;2016年03期

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本文編號：1761397