本文選題：生長抑制因子5 + 肺癌細(xì)胞�。� 參考：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：目的:肺癌已經(jīng)成為導(dǎo)致人類死亡的主要癌癥之一,其發(fā)病率和死亡率逐年增高。大多數(shù)肺癌患者確診時(shí)已處于癌癥晚期,其中50%以上的患者失去手術(shù)機(jī)會。而現(xiàn)有的治療方法對大多數(shù)肺癌患者療效甚微,因此亟需新的治療策略。研究表明,肺癌的發(fā)生、發(fā)展以及侵襲和轉(zhuǎn)移是個多基因參與、多步驟發(fā)生的過程,其中抑癌基因的失活在腫瘤的生長和侵襲過程中發(fā)揮重要作用。生長抑制因子(Inhibitor of Growth)屬于候選抑癌基因家族,目前發(fā)現(xiàn)了五個成員,包括ING1、ING2、ING3、ING4、ING5。研究表明,ING家族成員參與調(diào)控細(xì)胞生長、細(xì)胞凋亡和DNA損傷修復(fù)等過程。ING5作為該家族最新成員于2003年被首次報(bào)道,結(jié)果顯示ING5可以與P53相互作用并促進(jìn)P53轉(zhuǎn)錄活化,從而引起結(jié)腸癌細(xì)胞周期阻滯和凋亡;此外,ING5參與構(gòu)成兩種組蛋白乙�；D(zhuǎn)移酶(Histone acetyltransferase,HAT)復(fù)合體,并且參與組蛋白修飾和染色質(zhì)重構(gòu),通過與組蛋白結(jié)合而作為連接組蛋白和HAT的橋梁分子,提示ING5可能通過調(diào)控基因的表達(dá)而發(fā)揮抑癌作用;課題組前期研究發(fā)現(xiàn)ING5可以和細(xì)胞周期調(diào)控蛋白INCA1相互作用,抑制小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF細(xì)胞)增殖,并促進(jìn)CD95抗體引起的細(xì)胞凋亡,而在INCA1基因敲除的MEF細(xì)胞中上述作用則消失,表明ING5抑制細(xì)胞生長的作用依賴于和其他蛋白質(zhì)的相互作用。但是ing5如何發(fā)揮抑癌作用及其機(jī)制仍不明確,ing5在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用尚未見報(bào)道。腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為包括其增殖活性、遷移和侵襲能力,與臨床腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過建立ing5過表達(dá)和基因敲減的肺癌細(xì)胞株,從細(xì)胞和在體水平研究ing5對肺癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響及可能的機(jī)制。方法:實(shí)驗(yàn)一以a549和h1299兩株肺癌細(xì)胞為研究對象,采用慢病毒介導(dǎo)的方法分別建立a549細(xì)胞ing5過表達(dá)細(xì)胞系(a549-ing5)和h1299細(xì)胞ing5基因敲減細(xì)胞系(h1299-shing5)。在細(xì)胞水平采用細(xì)胞增殖和克隆形成實(shí)驗(yàn)研究ing5對肺癌細(xì)胞增殖能力的影響;采用細(xì)胞劃痕、遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)研究ing5對肺癌細(xì)胞侵襲能力的影響。實(shí)驗(yàn)二以裸鼠為研究對象,采用皮下接種和尾靜脈注射a549-control和a549-ing5細(xì)胞的方法分別建立裸鼠皮下移植瘤模型和尾靜脈注射肺癌細(xì)胞裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移模型,研究ing5在體內(nèi)對肺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力的影響。實(shí)驗(yàn)三為了探討ing5是否通過抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymaltransition,emt)發(fā)揮抑制肺癌侵襲作用,采用倒置顯微鏡和掃描電鏡觀察a549-control和a549-ing5形態(tài)學(xué)變化;qrt-pcr和westerblot檢測ing5對emt標(biāo)志蛋白分子在mrna和蛋白水平的影響。結(jié)果實(shí)驗(yàn)一1、成功構(gòu)建了a549細(xì)胞ing5過表達(dá)細(xì)胞系和h1299細(xì)胞ing5基因敲減細(xì)胞系:與a549-control比較,細(xì)胞系a549-ing5中ing5表達(dá)顯著增高;與h1299-shcontorl相比,細(xì)胞系h1299-shing5中ing5表達(dá)顯著降低。2、ing5過表達(dá)顯著抑制了a549細(xì)胞的增殖能力和克隆形成能力,而ing5基因敲減則顯著提高了h1299細(xì)胞的增殖能力和克隆形成能力。3、劃痕實(shí)驗(yàn)和遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ING5過表達(dá)的A549細(xì)胞遷移愈合能力明顯低于對照肺癌細(xì)胞,侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ING5過表達(dá)可顯著抑制A549細(xì)胞侵襲能力;而ING5基因敲減的H1299細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著高于對照肺癌細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)二1、裸鼠皮下荷瘤模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:ING5過表達(dá)顯著抑制裸鼠皮下成瘤及移植瘤的生長,ING5過表達(dá)肺癌細(xì)胞腫瘤體積較對照組顯著縮小。2、尾靜脈注射肺癌細(xì)胞裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移模型結(jié)果表明:A549-control組100%形成了肺部轉(zhuǎn)移瘤,注射A549-ING5細(xì)胞40%形成轉(zhuǎn)移瘤,且腫瘤轉(zhuǎn)移灶數(shù)量明顯低于對照組。實(shí)驗(yàn)三1、形態(tài)學(xué)研究結(jié)果表明:ING5過表達(dá)后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化,在倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)上皮樣細(xì)胞明顯增多,并聚集成簇;電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)ING5過表達(dá)后偽足明顯減少甚至消失。2、qRT-PCR和Western Blot結(jié)果顯示:ING5在mRNA和蛋白水平促進(jìn)E-cadherin的表達(dá),抑制N-cadherin、Snail和Slug的表達(dá)。結(jié)論1、ING5可以抑制肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲作用。2、ING5可以抑制肺癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)成瘤及生長和轉(zhuǎn)移能力。3、ING5通過抑制肺癌細(xì)胞EMT機(jī)制而抑制其侵襲能力。
[Abstract]:Objective: lung cancer has become a major cause of cancer death. The morbidity and mortality increased year by year. Most patients are diagnosed with lung cancer in advanced cancer, of which more than 50% of the patients lost the chance of operation. The current treatment methods for most patients with lung cancer treatment ineffective, so the new strategy needed treatment. The study shows that the lung cancer the occurrence, development, invasion and metastasis is a multistep process involving multiple genes, which occur, inactivation of tumor suppressor genes play an important role in the growth and invasion of tumor. The growth inhibitory factor (Inhibitor of Growth) is a candidate tumor suppressor gene family, five members have been found so far include ING1 ING2, ING3, ING4, ING5. study showed that ING family members are involved in the regulation of cell growth, cell apoptosis and DNA damage repair process of.ING5 as a new member of the family for the first time in 2003 Together, the results show that ING5 can interact with P53 and promote P53 transcription activation, causing the node cycle arrest and apoptosis of colon cancer cells; in addition, ING5 is involved in the composition of the two kinds of histone acetyltransferase (Histone acetyltransferase HAT) complex, and involved in histone modification and chromatin remodeling, and as a bridge connecting the molecular group protein and HAT combined with proteins, suggesting that ING5 may regulate gene expression and play the role of tumor suppressor; previous study found that ING5 and cell cycle regulatory protein INCA1 interaction, inhibition of mouse embryonic fibroblasts (MEF cells) proliferation and promote apoptosis induced by CD95 antibody, and in INCA1 in addition to the role of gene knock in MEF cells disappeared, showed that ING5 inhibits the growth of cells and other dependent protein interactions. But ING5 how to play the role of tumor suppressor and The mechanism is still unclear, the ING5 role in the development of lung cancer has not been reported. The biological behavior of malignant tumor cells including proliferation, migration and invasion, and is closely related to tumor growth and metastasis. The expression of ING5 and gene knockdown cells from lung cancer cell lines, and influence study on the level of ING5 on the proliferation and invasion of lung cancer cells and its possible mechanism. Methods: experiment with A549 and H1299 two cell lines as the research object, A549 cell ING5 expression cell lines were established by lentivirus mediated (a549-ing5) and H1299 cell ING5 gene knockdown cell lines (h1299-shing5). The cell proliferation and clone formation at the cellular level experimental study of effect of ING5 on lung cancer cell proliferation; cell migration and invasion by scratches, experimental study of ING5 on the invasion of lung cancer cells In experiment two. The influence of nude mice as the research object, were established in nude mice and tail vein injection in nude mice lung cancer cell metastasis in vivo model by subcutaneous inoculation and intravenous injection of a549-control and a549-ing5 cells, the in vivo effects of ING5 on proliferation and metastasis of lung cancer cells. In experiment three, in order to investigate whether ING5 through inhibition of epithelial mesenchymal transition (epithelial-mesenchymaltransition, EMT) play a role in inhibiting invasion of lung cancer, observe the a549-control and a549-ing5 morphological changes under inverted microscope and scanning electron microscope; qRT-PCR and westerblot detection of ING5 EMT marks the effect of protein molecules at mRNA and protein levels. The results of Experiment 1, the successful construction of A549 cells overexpressing ING5 and H1299 cell lines cell ING5 gene knockdown cell lines: compared with a549-control, a549-ing5 and ING5 expression in the cell lines increased significantly; and Compared to h1299-shcontorl, h1299-shing5 and ING5 expression in the cell lines significantly decreased.2, overexpression of ING5 significantly inhibited the proliferation and colony formation ability of A549 cells, while ING5 knockdown significantly increased the proliferation and colony formation ability of H1299 cells.3, scratch assay and migration experiment results show that ING5 expression of A549 cell migration and wound healing the ability of lung cancer cells invasion was significantly lower than the control, experimental results show that overexpression of ING5 can inhibit the invasion ability of A549 cells; ING5 gene on H1299 cell migration and invasion by lung cancer cells was significantly higher than that of control. In experiment two, 1, the experimental results showed that the tumor bearing nude mice model of overexpression of ING5 significantly inhibited the tumor formation and transplantation the growth of tumor, overexpression of ING5 lung cancer cell volume reduced significantly.2, intravenous injection of nude mice lung cancer cell metastasis in vivo model results Show: A549-control group of 100% forms of lung metastases, injection of A549-ING5 cells 40% formation of metastasis, and tumor metastasis number was significantly lower than the control group. The experimental results show that three 1 Morphological Studies: overexpression of ING5 in cell morphology changed significantly, observed epithelioid cells were increased under the microscope, and clustered; the over expression of ING5 after pseudopodia was decreased or even disappeared..2 were observed under electron microscope, qRT-PCR and Western Blot showed that ING5 expression in mRNA and protein levels, promote E-cadherin inhibition of N-cadherin, expression of Snail and Slug. Conclusion 1, ING5 can inhibit the proliferation of lung cancer cells, migration and invasion of.2, ING5 can inhibit lung cancer cell in vivo tumor growth and metastasis and inhibit the invasion ability of.3 and ING5 through the inhibition mechanism of EMT lung cancer cells.

【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2

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本文編號：1753775