本文選題：Wnt5a + CCL25/CCR9　； 參考：《武漢大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究背景及目的：急性T淋巴細(xì)胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia, T-ALL)是一種起源于T系淋巴祖細(xì)胞的侵襲性血液系統(tǒng)疾病。T-ALL表現(xiàn)為骨髓中未成熟T淋巴細(xì)胞彌漫性浸潤、高白細(xì)胞比例、縱膈腫大以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累等特征,其幼稚細(xì)胞可以侵犯骨髓外組織,如腦膜、胸腺、性腺、肝、肺、脾及淋巴結(jié)等,引起相應(yīng)病變。其惡性增殖和侵襲程度與患者的預(yù)后密切相關(guān)。隨著高效治療手段的應(yīng)用,兒童患者的治愈率已經(jīng)達(dá)到70%。但是,與兒童患者相比,成人患者的預(yù)后較差。趨化因子受體9(CC chemokine receptor 9, CCR9)是高表達(dá)在T-ALL中的一種趨化因子受體,CCR9與其唯一配體CC型趨化因子25(C-C motif chemokine ligand 25, CCL25)結(jié)合后能夠顯著增強(qiáng)白血病細(xì)胞的浸潤。Wnt家族是一類含有豐富半胱氨酸的分泌性糖蛋白,參與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲。Wnt與趨化因子/趨化因子受體關(guān)系密切,有研究表明：趨化因子可促進(jìn)特定Wnt分子的表達(dá)；另有報(bào)道顯示某些Wnt分子參與趨化因子介導(dǎo)的細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。我們實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)CCL25/CCR9通路介導(dǎo)T-ALL細(xì)胞系MOLT4細(xì)胞的轉(zhuǎn)移,然而在T-ALL中有關(guān)CCL25/CCR9與Wnt家族的關(guān)系尚未見報(bào)道。本課題旨在探討成人T-ALL中,CCL25/CCR9與Wnt家族的關(guān)系,尋找CCL25/CCR9調(diào)控的關(guān)鍵Wnt成員,為闡明CCL25/CCR9介導(dǎo)的成人T-ALL轉(zhuǎn)移(浸潤)提供理論依據(jù),為成人T-ALL的治療提供新的潛在治療靶標(biāo)。研究內(nèi)容和方法：以高表達(dá)CCR9的成人T-ALL細(xì)胞系MOLT4細(xì)胞為研究對象,RT-PCR檢測CCL25對MOLT4細(xì)胞所有Wnt成員表達(dá)的影響,篩選出變化最明顯的Wnt成員；實(shí)時(shí)定量PCR和Western Blot驗(yàn)證CCL25對MOLT4細(xì)胞Wnt5a表達(dá)的影響；Western Blot檢測PKC在CCL25誘導(dǎo)MOLT4細(xì)胞Wnt5a表達(dá)過程中的作用。以闡明CCL25對MOLT4細(xì)胞Wnt5a表達(dá)的影響及調(diào)控分子機(jī)制。GSEA (Gene Set Enrichment Analysis)分析Wnt5a在成人T-ALL中可能參與的生物學(xué)過程；Western Blot、Trans well和Matrigel-Transwell檢測Wnt5a對MOLT4細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響,以及抑制或沉默PI3K/Akt或RhoA對Wnt5a誘導(dǎo)的MOLT4細(xì)胞遷移和侵襲的影響；激光共聚焦顯微鏡和掃描電鏡分別檢測Wnt5a對MOLT4細(xì)胞極化和細(xì)胞偽足形成的影響,以及抑制或沉默PI3K/Akt或RhoA對Wnt5a誘導(dǎo)的MOLT4細(xì)胞極化和細(xì)胞偽足形成的影響。以闡明Wnt5a對MOLT4遷移和侵襲能力的影響及其調(diào)控機(jī)制。Transwell和Matrigel-Transwell檢測Wnt5a對CCL25介導(dǎo)的MOLT4細(xì)胞遷移和侵襲的影響；MOLT4細(xì)胞SCID小鼠體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)檢測Wnt5a對CCL25介導(dǎo)的MOLT4細(xì)胞轉(zhuǎn)移(浸潤)的影響；Western Blot檢測Wnt5a在CCL25介導(dǎo)的MOLT4細(xì)胞RhoA活化過程中的作用。以闡明Wnt5a對CCL25介導(dǎo)的MOLT4細(xì)胞轉(zhuǎn)移(浸潤)的影響及分子機(jī)制。研究結(jié)果：Wnt家族中僅Wnt2b, Wnt5a和Wnt10b在MOLT4細(xì)胞中有明顯表達(dá),而其他15個(gè)Wnt成員幾乎不表達(dá),其中Wnt5a經(jīng)CCL25處理后表達(dá)水平顯著升高；抑制PKC后顯著降低了CCL25誘導(dǎo)的Wnt5a表達(dá),相反,激活PKC后Wnt5a表達(dá)顯著上升。GSEA基因富集分析的結(jié)果提示W(wǎng)nt5a在成人T-ALL中與多種與遷移侵襲生物學(xué)過程相關(guān)；體外遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)證實(shí)Wnt5a可以促進(jìn)MOLT4細(xì)胞的遷移和侵襲,抑制或沉默PI3K/Akt或RhoA后顯著降低Wnt5a誘導(dǎo)的MOLT4細(xì)胞的遷移和侵襲。激光共聚焦結(jié)果顯示W(wǎng)nt5a促進(jìn)了MOLT4細(xì)胞極化,抑制或沉默PI3K/Akt或RhoA后顯著降低了Wnt5a誘導(dǎo)的MOLT4細(xì)胞極化。掃描電鏡結(jié)果顯示W(wǎng)nt5a促進(jìn)了MOLT4細(xì)胞片狀偽足和絲狀偽足形成,抑制或沉默PI3K/Akt或RhoA后顯著降低了Wnt5a誘導(dǎo)的MOLT4細(xì)胞片狀偽足和絲狀偽足形成。遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾Wnt5a后顯著降低了CCL25誘導(dǎo)的MOLT4細(xì)胞遷移和侵襲,相反,外源Wnt5a可顯著增強(qiáng)CCL25誘導(dǎo)的MOLT4細(xì)胞遷移和侵襲。在動物模型中,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示W(wǎng)nt5a處理組骨髓中MOLT4細(xì)胞比例顯著低于Control組,而Wnt5a和CCL25單獨(dú)或共同處理組PBMC中MOLT4細(xì)胞比例都顯著低于Control組;4組MOLT4細(xì)胞異種移植小鼠的體重都顯著低于Normal組,而器官體重比都顯著高于Normal組;4組MOLT4細(xì)胞異種移植小鼠中只有Wnt5a+CCL25處理組的小鼠肝臟出現(xiàn)明顯病變；HE染色的結(jié)果顯示W(wǎng)nt5a處理組、CCL25處理組和Wnt5a+CCL25處理組的MOLT4細(xì)胞向肝臟浸潤的水平都顯著高于Control組,且Wnt5a+CCL25處理組的MOLT4細(xì)胞向肝臟浸潤水平顯著高于Wnt5a處理和CCL25處理組,表明Wnt5a可單獨(dú)或協(xié)同CCL25促進(jìn)MOLT4細(xì)胞向肝臟轉(zhuǎn)移(浸潤)。Western Blot結(jié)果顯示W(wǎng)nt5a可增強(qiáng)CCL25介導(dǎo)的MOLT4細(xì)胞RhoA的活化,提示W(wǎng)nt5a可能通過協(xié)同CCL25誘導(dǎo)RhoA的活化參與CCL25介導(dǎo)的MOLT4細(xì)胞向其他器官的轉(zhuǎn)移(浸潤)。結(jié)論：1. CCL25/CCR9通過活化和上調(diào)PKC促進(jìn)成人T-ALL細(xì)胞系MOLT4細(xì)胞Wnt5a的表達(dá)。2. Wnt5a通過PI3K/AKT-RhoA途徑促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生極化和細(xì)胞偽足生成來調(diào)節(jié)成人T-ALL細(xì)胞系MOLT4細(xì)胞遷移和侵襲,Wnt5a有可能成為治療成人T-ALL的靶點(diǎn)。3. Wnt5a協(xié)同CCL25誘導(dǎo)RhoA的活化參與CCL25介導(dǎo)的MOLT4細(xì)胞向其他器官轉(zhuǎn)移(浸潤)。
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【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R733.71
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本文編號：1750630