發(fā)布時(shí)間：2018-04-13 15:25

  本文選題：小鼠乳腺癌細(xì)胞系4T1 + CCL5��； 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：目的:乳腺癌作為威脅女性身心健康首位的惡性腫瘤,發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。由于發(fā)病原因尚未完全闡明,因此預(yù)防、早期篩查和診斷便成為治愈的關(guān)鍵,這就使得分子生物技術(shù)倍受關(guān)注。CCL5趨化細(xì)胞因子是一種炎癥細(xì)胞因子,趨化T細(xì)胞和單核細(xì)胞,在腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中具有多重效應(yīng),包括抑制腫瘤細(xì)胞的免疫效應(yīng)、促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、新血管的生成和轉(zhuǎn)移等,也是乳腺腫瘤細(xì)胞表達(dá)的主要趨化因子,與乳腺癌的進(jìn)展息息相關(guān),p38是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)通路,可以調(diào)節(jié)很多細(xì)胞因子的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞系引起CCL5的表達(dá)升高的機(jī)制展開進(jìn)一步研究。方法:1用RT-PCR和Western Blot的方法檢測(cè)小鼠乳腺癌細(xì)胞系4T1表面TLR4的表達(dá)及誘導(dǎo)表達(dá)。2 LPS誘導(dǎo)4T1細(xì)胞,提取總RNA,用RT-PCR檢測(cè)MCP-1、VEGF和CCL5在基因水平的表達(dá)情況。同時(shí)用實(shí)時(shí)定量PCR的方法進(jìn)行檢測(cè)MCP-1、VEGF和CCL5在基因水平的表達(dá)情況。3用Western Blot的方法檢測(cè)LPS誘導(dǎo)4T1細(xì)胞后MAPK中T-p38和P-p38、T-Erk和P-pErk、T-JNK和P-JNK及NF-κB中T-p65和P-p65的蛋白表達(dá)變化。4采用實(shí)時(shí)定量PCR的方法來檢測(cè)使用通路抑制劑后LPS誘導(dǎo)的4T1細(xì)胞的CCL5的表達(dá)。5構(gòu)建攜帶目的基因重組質(zhì)粒并在小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。在熒光素酶檢測(cè)儀上進(jìn)行熒光素酶的數(shù)據(jù)測(cè)定。6劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)p38抑制劑對(duì)4T1細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響。7用免疫印跡法來檢測(cè)使用p38抑制劑后的4T1細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果1 LPS誘導(dǎo)及未誘導(dǎo)的兩組4T1細(xì)胞在基因和蛋白水平均有TLR4的表達(dá)。2在基因水平上,LPS誘導(dǎo)4T1細(xì)胞組與未誘導(dǎo)4T1細(xì)胞組相比較,CCL5表達(dá)明顯升高,而MCP-1和VEGF的表達(dá)沒有明顯變化。3 LPS刺激4T1細(xì)胞后,可以導(dǎo)致p38、Erk、JNK和p65明顯磷酸化升高。4 CCL5在使用p38和p65的阻斷劑后的表達(dá)有差異,且p38阻斷劑組與p65阻斷劑組相比而言差異更加顯著,阻斷Erk、JNK后CCL5的表達(dá)無明顯變化。5熒光素酶檢測(cè)的結(jié)果表明,LPS在4T1細(xì)胞上導(dǎo)致的CCL5表達(dá)的增高是通過導(dǎo)致啟動(dòng)子表達(dá)增高實(shí)現(xiàn)的。6 p38抑制劑可以抑制4T1細(xì)胞的遷移能力而對(duì)侵襲能力沒有影響7 p38抑制劑可以抑制EMT的相關(guān)蛋白β-catenin和Vimentin的表達(dá),而對(duì)Snail的表達(dá)無影響。結(jié)論:1 LPS誘導(dǎo)4T1細(xì)胞使得CCL5表達(dá)增高,這種誘導(dǎo)增高是通過使得CCL5啟動(dòng)子的能力增強(qiáng)來實(shí)現(xiàn)的。2 p38抑制劑可以抑制4T1細(xì)胞的遷移能力和EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)。
[Abstract]:Objective: the incidence of breast cancer is increasing year by year as the first malignant tumor threatening women's physical and mental health.Since the cause of the disease has not been fully clarified, prevention, early screening and diagnosis are the key to cure, which makes molecular biotechnology pay more attention to. CCL5 chemokine is an inflammatory cytokine, chemokine T cell and monocyte.It has multiple effects in tumor growth and metastasis, including inhibiting the immune effect of tumor cells, promoting tumor growth, and the formation and metastasis of new blood vessels. It is also the main chemokine of breast cancer cell expression.P38 is an important cellular signaling pathway that regulates the expression of many cytokines.The aim of this study was to investigate the mechanism of CCL5 expression in mouse breast cancer 4T1 cell line induced by LPS.Methods RT-PCR and Western Blot were used to detect the expression of TLR4 on the surface of mouse breast cancer cell line 4T1, and the induced expression of .2 LPS was used to induce 4T1 cells. The total RNAs were extracted, and the expression of MCP-1VEGF and CCL5 at gene level was detected by RT-PCR.Meanwhile, real-time quantitative PCR was used to detect the expression of MCP-1VEGF and CCL5 at the gene level. Western Blot was used to detect the changes of T-p38 and P-p38 T-Erk and P-pErkton-JNK and P-JNK in 4T1 cells induced by LPS and T-p65 and P-p65 in NF- 魏 B.The expression of CCL5 in 4T1 cells induced by LPS was detected by quantitative PCR. 5. The recombinant plasmid carrying the target gene was constructed and transfected into murine macrophages RAW264.7 by liposome.The effect of p38 inhibitor on the migration and invasion of 4T1 cells by Transwell assay. 7. Western blot method was used to detect 4T1 cells after p38 inhibitor was used to detect the effect of p38 inhibitor on the migration and invasion of 4T1 cells.Expression of EMT related proteins.Results 1 the expression of TLR4 was found in both LPS induced and uninduced 4T1 cells at both gene and protein levels. The expression of CCL5 in LPS-induced 4T1 cells was significantly higher than that in uninduced 4T1 cells at the gene level.However, the expression of MCP-1 and VEGF did not change significantly after 3. 3 LPS stimulated 4T1 cells, which resulted in a significant increase in phosphorylation of p38 Erkon JNK and p65 in 4T1 cells. There was a difference in the expression of 4. 4 CCL5 after the use of p38 and p65 blockers.The difference between p38 blocker group and p65 blocker group was more significant.There was no significant change in the expression of CCL5 after blocking CCL5. 5 the results of luciferase detection showed that the increase of CCL5 expression induced by LPs in 4T1 cells could inhibit the migration of 4T1 cells by inducing the increase of promoter expression.The expression of 尾 -catenin and Vimentin in EMT was inhibited by 7p38 inhibitor.However, there was no effect on the expression of Snail.Conclusion 1 LPS induces an increase in CCL5 expression in 4T1 cells. This increase is achieved by enhancing the ability of CCL5 promoters to inhibit the migration of 4T1 cells and the expression of EMT related proteins.
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.9

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本文編號(hào)：1745082