本文選題：miR-409-3p + 乳腺癌　； 參考：《山東大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究背景乳腺癌已成為嚴(yán)重危害婦女健康的惡性腫瘤,全球每年新增接近130萬乳腺癌患者,大約有40萬人因乳腺癌死亡。在中國,我們面臨的形勢同樣非常嚴(yán)峻,乳腺癌患者每年的死亡數(shù)量和新發(fā)數(shù)量分別占全世界的9.6%和12.2%,乳腺癌目前已成為中國女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤,在癌癥死亡原因中位居第六。近年來圍繞乳腺癌發(fā)病機(jī)理的研究已取得了一定的成績,且針對(duì)部分乳腺癌相關(guān)的靶點(diǎn)也已研制出相應(yīng)的靶向治療藥物,并用于臨床治療,但是療效尚不能令人滿意,需要進(jìn)一步深入研究乳腺癌的發(fā)病機(jī)制。MicroRNAs是一類內(nèi)源性非編碼小RNA,長度約19-25個(gè)核苷酸序列,它通過與靶基因mRNA的3'端非翻譯區(qū)結(jié)合,參與基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控,進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、分化、代謝等生物學(xué)作用。miRNA已被證明在心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用。miRNA的異常表達(dá)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中可能扮演關(guān)鍵的角色,可以作為原癌基因或抑癌基因發(fā)揮作用。目前研究發(fā)現(xiàn)多個(gè)miRNAs包括miR-31, miR-205, miR-335, miR-200 family, miR-124, miR-340和miR-196s具有腫瘤抑制基因的功能,已經(jīng)證明在乳腺癌中表達(dá)下調(diào)。然而,miR-10b, miR-373, miR-520c, miR-9和miR-221/222在乳腺癌發(fā)生和發(fā)展中起到原癌基因作用。miR-409-3p位于染色體14q32.31,與腫瘤的形成及進(jìn)展有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)miR-409-3p可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、凋亡,抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移,同樣還發(fā)現(xiàn),miR-409-3p在膀胱癌、肺癌及結(jié)腸癌中起到腫瘤抑制因子的作用,但是它在乳腺癌中扮演的角色仍然不清楚。研究目的研究miR-409-3p在乳腺癌細(xì)胞和組織中的表達(dá)特性,探討miR-409-3p對(duì)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及其在乳腺癌中所發(fā)揮的生物學(xué)作用機(jī)制,為深入了解乳腺癌發(fā)病的分子機(jī)制和尋找新的分子治療靶點(diǎn)奠定理論基礎(chǔ)。研究方法1.組織樣本收集與細(xì)胞培養(yǎng)收集30例新鮮的乳腺癌組織及其癌旁正常組織,液氮中速凍。乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231, MCF-7, MDA-MB-468, T47D及人正常乳腺上皮細(xì)胞系HBL-100均培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,置于5% CO2、37℃及濕度飽和的環(huán)境中培養(yǎng)。2.慢病毒生產(chǎn)和轉(zhuǎn)導(dǎo)擴(kuò)增miR-409-3p序列,并克隆到HU6-MCS-PGK-EGFP慢病毒載體,感染293T細(xì)胞,獲得穩(wěn)定表達(dá)miR-409-3p的病毒顆粒,并進(jìn)一步轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和MDA-MB-468細(xì)胞,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3.RNA提取與實(shí)時(shí)定量PCR分析使用TRIzol試劑從組織和培養(yǎng)的細(xì)胞中提取總RNA。 RNA標(biāo)本中加入miRNA特異性的RT引物(莖環(huán)結(jié)構(gòu)的),進(jìn)一步逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。SYBR Green摻入法熒光定量PCR測定miR-409-3p或AKT1 mRNA表達(dá)水平,U6或β-actin作為內(nèi)參。使用2-ΔΔCt方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。4. Western blot參考文獻(xiàn)中Western blot實(shí)驗(yàn)步驟,裂解細(xì)胞收集蛋白,通過SDS-PAGE電泳分離全部蛋白,并轉(zhuǎn)膜,后將膜加入Aktl或p-Akt1一抗孵育,然后洗滌和暴露在HRP標(biāo)記的二抗中,GAPDH作為內(nèi)參。最后經(jīng)化學(xué)發(fā)光試劑處理,觀察結(jié)果。Western blot用來檢測細(xì)胞或裸鼠腫瘤組織中Akt1蛋白表達(dá)水平。5.質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)染克隆AKT1的開放讀碼區(qū)(不含3'UTR)至表達(dá)載體pcDNA3.1質(zhì)粒中,然后轉(zhuǎn)染至miR-409-3p穩(wěn)定表達(dá)的MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行“營救”實(shí)驗(yàn)。在熒光素酶實(shí)驗(yàn)中,將野生型或突變型AKT1的3'UTR擴(kuò)增并克隆到的pGL3熒光素酶報(bào)告基因載體中,使用QuickChange定向突變?cè)噭┖袑形稽c(diǎn)3'UTR突變。使用脂質(zhì)體2000試劑進(jìn)行質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染。6.細(xì)胞增殖和克隆形成實(shí)驗(yàn)MTT實(shí)驗(yàn)：收集細(xì)胞接種于96孔板,分別培養(yǎng)1,2,3,4和5天。其后,在每個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)上向每孔加入MTT溶液,使用酶標(biāo)儀測定在490nm處吸光度。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)：收集細(xì)胞接種于6孔板,培養(yǎng)14天,克隆用30%的甲醛固定,用結(jié)晶紫染色液染色。用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行克隆計(jì)數(shù)。7.細(xì)胞遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)按照Transwell說明書進(jìn)行操作,用不含Matrigel膠的Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移,用含Matrigel膠的Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的侵襲。24小時(shí)后,穿到下室的細(xì)胞被固定、染色。在高倍鏡下隨機(jī)選取5各視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。8.體內(nèi)成瘤試驗(yàn)將表達(dá)miR-409-3p的MDA-MB-231細(xì)胞和陰性對(duì)照細(xì)胞接種到裸鼠右側(cè)腋下。每4天測量腫瘤生長的直徑。28天后,將小鼠安樂死,測量最終腫瘤的重量及體積。選取一部分腫瘤組織,應(yīng)用western blot檢測Aktl,免疫組化法檢測Ki-67。9.雙熒光素酶報(bào)告基因檢測驗(yàn)證靶基因?qū)⒁吧突蛲蛔冃虯ktl-3'UTR表達(dá)載體與hU6-miR-409-3p或空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MDA-MB-231和MDA-MB-468細(xì)胞,應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。10.統(tǒng)計(jì)分析所有試驗(yàn)至少獨(dú)立重復(fù)三次。所有的數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述。統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 13.0軟件。不同組之間使用t檢驗(yàn)(雙側(cè))進(jìn)行比較。差異顯著性設(shè)為P0.05。結(jié)果1.miR-409-3p在乳腺癌組織及細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)為探究miR-409-3p在人類乳腺癌中的作用,我們首先檢測miR-409-3p在乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231, MCF-7, MDA-MB-468, T47D及乳腺癌上皮細(xì)胞系HBL-100中的表達(dá)水平。與HBL-100相比,所有檢測細(xì)胞系中miR-409-3p的表達(dá)均下調(diào),但下調(diào)的程度不一。同時(shí),miR-409-3p在乳腺癌組織中較正常癌旁組織表達(dá)顯著降低。這些結(jié)果表明miR-409-3p的下調(diào)可能參與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展。2. miR-409-3p抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲為探究miR-409-3p在乳腺癌細(xì)胞增殖中的影響,我們應(yīng)用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法構(gòu)建miR-409-3p穩(wěn)定表達(dá)的MDA-MB-231和MDA-MB-468細(xì)胞系。首先應(yīng)用MTT比色法評(píng)估m(xù)iR-409-3p對(duì)細(xì)胞生長的影響,結(jié)果顯示,miR-409-3p轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長被顯著抑制。然后行平板集落形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步評(píng)價(jià)miR-409-3p對(duì)乳腺癌細(xì)胞克隆形成的影響,結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-409-3p的乳腺癌細(xì)胞集落形成能力顯著降低。這些結(jié)果表明miR-409-3p抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖。另外在Transwell實(shí)驗(yàn)中,miR-409-3p過表達(dá)可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移及侵襲。這些數(shù)據(jù)表明miR-409-3p在乳腺癌中起到腫瘤抑制作用。3. miR-409-3p抑制裸鼠腫瘤移植物生長為檢測miR-409-3p對(duì)體內(nèi)腫瘤生長的影響,分別將穩(wěn)定表達(dá)miR-409-3p和陰性對(duì)照的MDA-MB-231細(xì)胞皮下注射到小鼠右側(cè)腋下,28天后,將小鼠處死收集腫瘤。結(jié)果顯示：miR-409-3p過表達(dá)組腫瘤生長速度最慢。另外,較對(duì)照組相比,腫瘤重量及Ki-67陽性細(xì)胞在miR-409-3p穩(wěn)定表達(dá)組中顯著降低。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-409-3p可抑制乳腺癌腫瘤移植物的生長。4.原癌基因AKT1是miR-409-3p的一個(gè)直接下游靶點(diǎn)(1)為了解miR-409-3p如何在乳腺癌中發(fā)揮其作用,我們利用TargetScan和miRanda兩個(gè)獨(dú)立的數(shù)據(jù)庫尋找它的靶向基因,并考慮到對(duì)乳腺癌病理生理過程的影響,最終AKT1被確定為候選靶基因。為確定AKT1是miR-409-3p的一個(gè)直接靶點(diǎn),我們分別構(gòu)建了含有野生型AKT1-3'UTR及突變型AKT1-3'UTR的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒。然后進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因檢測,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：miR-409-3p與野生型AKT1-3'UTR共轉(zhuǎn)染后,熒光素酶活性顯著下降,而miR-409-3p與突變型AKT1-3'UTR共轉(zhuǎn)染后,熒光素酶的活性無明顯變化。這表明miR-409-3p可直接作用于AKT1的3'UTR, AKT1為miR-409-3p的直接靶基因。(2)在miR-409-3p穩(wěn)定表達(dá)的MDA-MB-231和MDA-MB-468細(xì)胞系中,AKT1 mRNA的表達(dá)水平較對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而Western blot分析顯示MDA-MB-231-miR-409-3p和MDA-MB-468-miR-409-3p穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株中Akt1蛋白水平的表達(dá)較對(duì)照組明顯降低。在轉(zhuǎn)染miR-409-3p抑制劑的T47D細(xì)胞系中,Aktl蛋白水平的表達(dá)較對(duì)照組顯著提高。在接種穩(wěn)定表達(dá)miR-409-3p的MDA-MB-231細(xì)胞的裸鼠所獲得的腫瘤組織中Aktl蛋白水平的表達(dá)較對(duì)照組明顯降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-409-3p可以抑制AKT1蛋白的翻譯。5.過表達(dá)AKT1可解除miR-409-3p對(duì)細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲的影響我們將敲除3'UTR的AKT1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入miR-409-3p高表達(dá)的MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行營救實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染敲除3'UTR的AKT1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后AKT1表達(dá)顯著增高。MTT及克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示過表達(dá)AKT1能夠明顯逆轉(zhuǎn)miR-409-3p對(duì)細(xì)胞增殖及克隆形成的抑制。另外,AKT1的過表達(dá)還能夠逆轉(zhuǎn)miR-409-3p對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)移及侵襲的抑制�？傊�,營救實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示過表達(dá)AKT1能夠解除miR-409-3p對(duì)細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲的影響。結(jié)論1. miR-409-3p在乳腺癌組織及乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)下降,提示miR-409-3p在乳腺癌中可能起到腫瘤抑制因子的作用。2.過表達(dá)miR-409-3p能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移。3.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示過表達(dá)miR-409-3p能顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的成瘤能力,表明miR-409-3p在乳腺癌中起腫瘤抑制因子的作用。4. miR-409-3p參與調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移可能是通過抑制靶基因Aktl發(fā)揮作用。5.過表達(dá)AKT1可解除miR-409-3p對(duì)細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響。
[Abstract]:It has been shown that miR - 409 - 3P plays a key role in the development of breast cancer . It has been shown that miR - 409 - 3P plays a key role in the development of breast cancer . It is also found that miR - 409 - 3P plays a key role in the development of breast cancer . It is also found that miR - 409 - 3P plays a key role in the development of breast cancer . It is also found that miR - 409 - 3P plays a key role in the development of breast cancer . Human breast cancer cell line MDA - MB - 231 and MDA - MB - 468 were cloned into HU6 - MCS - PGK - EGFP slow virus vector , and further transfected into breast cancer cell line MDA - MB - 231 and MDA - MB - 468 cells for subsequent experiments . miRNA - specific RT primers ( stem ring structure ) were added to RNA samples , and the cDNA was further transcribed into cDNA . SYBR Green incorporation method fluorescence quantitative PCR was used to determine the expression level of miR - 409 - 3 or AKT1 mRNA , and the expression level of U6 or 尾 - actin was used as internal reference . The expression level of Akt1 protein in tumor tissues of nude mice was determined by Western blot . After 24 hours , the cells were cultured for 1 , 2 , 3 , 4 and 5 days . The results showed that the expression of Akt1 protein decreased significantly after co - transfection of miR - 409 - 3P with wild - type AKT1 - 3 ' . The results showed that the expression of Aktl protein was significantly lower than that in the control group .

【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.9

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