本文選題：卵巢惡性腫瘤 + 多藥耐藥��； 參考：《廣西醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：第一章 葉酸代謝酶類的表達(dá)與生物功能對卵巢惡性腫瘤多藥耐藥影響的研究進(jìn)展(綜述)卵巢惡性腫瘤嚴(yán)重威脅婦女生命和健康,其發(fā)病率在婦科惡性腫瘤中居第三位,僅次于宮頸癌,宮體癌,而其死亡率居首位。卵巢癌發(fā)病隱匿,很多患者在出現(xiàn)癥狀之前已有腹腔轉(zhuǎn)移,確診時60%-70%患者已屬于晚期。目前公認(rèn)的最佳治療方法以手術(shù)為主,輔以鉑類和紫杉醇聯(lián)合化療f一線化療),配合放療、生物學(xué)治療等,但至少有60%的患者最終出現(xiàn)獲得性耐藥,晚期患者五年生存率僅為30%-40%。卵巢癌多藥耐藥極大地影響了卵巢癌患者對化療的敏感性,是限制其臨床療效的主要原因。卵巢癌耐藥的產(chǎn)生過程是一個多因素、多基因、多途徑、多步驟的復(fù)雜過程,目前對于卵巢癌多藥耐藥產(chǎn)生機(jī)制的研究主要集中在耐藥相關(guān)基因及其表達(dá)產(chǎn)物的研究；耐藥有關(guān)酶類的研究；其他與耐藥相關(guān)物質(zhì)的研究。近年來對卵巢癌多藥耐藥的研究也取得新的進(jìn)展,如卵巢癌細(xì)胞單層培養(yǎng)向三維培養(yǎng)的轉(zhuǎn)變：腫瘤微環(huán)境對耐藥產(chǎn)生的影響；腫瘤轉(zhuǎn)移對耐藥的影響等。但卵巢癌多藥耐藥機(jī)制極為復(fù)雜,目前尚未完全研究明確,卵巢癌多藥耐藥進(jìn)一步研究,在臨床上預(yù)防耐藥、控制耐藥、逆轉(zhuǎn)耐藥,尋找高效低毒的新型藥物,已成為目前急需解決的問題。葉酸的參與脫氧核糖核酸合成和細(xì)胞內(nèi)甲基化反應(yīng),是體內(nèi)重要甲基供體,可以通過干擾DNA甲基化與合成化參與腫瘤發(fā)生發(fā)展。葉酸不能被人體直接利用,需一系列葉酸代謝酶類將其分解活化后才能在人體發(fā)揮生物學(xué)功能。因此葉酸代謝酶類能保持基因組的穩(wěn)定,影響體內(nèi)DNA合成和修復(fù),以及正常甲基化,葉酸代謝酶活性的變化可導(dǎo)致DNA合成修復(fù)異常、甲基化異常、基因組不穩(wěn)定等,葉酸代謝酶基因多態(tài)性、葉酸缺乏或葉酸代謝障礙與腫瘤的形成關(guān)系密切。目前,葉酸代謝酶單核苷酸基因多態(tài)性在腫瘤的作用已是分子流行病學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。FOLR1、MTRR和DHFR等是葉酸代謝通路中重要的酶,其活性的變化影響葉酸的正常代謝、脫氧核苷酸三磷酸鹽的生物合成以及DNA甲基化反應(yīng),進(jìn)而在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展扮演重要角色。FOLR1是具有高親和力的葉酸受體,其位于細(xì)胞膜介導(dǎo)葉酸的胞吞途徑,有研究表明,FOLR1上皮來源的惡性組織中表達(dá)明顯增高,抑制FOLR1,細(xì)胞的化療敏感性得到增加；MTRR能維持甲硫氨酸合成酶的活性,在MTR活化過程中發(fā)揮重要作用,影響Hcy代謝和DNA甲基化,有研究表明,MTRR A66G使其活性降低后,能導(dǎo)致心血管疾病、畸形兒以及腫瘤的發(fā)生；DHFR能降解葉酸,使其變?yōu)樗臍淙~酸(即活性葉酸),四氫葉酸也就是甲基供體,有研究表明,DHFR表達(dá)增高能增加細(xì)胞的耐藥性。目前國內(nèi)外有許多調(diào)查研究了葉酸代謝酶與腫瘤之間的關(guān)系,但研究成果之間仍存在不少爭議。葉酸代謝酶作為一個極富前景的研究方向,其與卵巢癌發(fā)生發(fā)展、多藥耐藥之間的關(guān)系尚很不明確,值得我們進(jìn)一步探索發(fā)現(xiàn)。第二章 FOLR1、MTRR和DHFR的表達(dá)對卵巢惡性腫瘤多藥耐藥中的臨床意義目的：研究卵巢惡性腫瘤組織中葉酸結(jié)合蛋白(FOLR1)、甲硫氨酸合成酶還原酶(MTRR)、二氫葉酸還原酶(DHFR)的表達(dá)及其臨床意義。方法：采用Western Blot檢測30例正常卵巢組織、50例卵巢良性腫瘤組織及80例卵巢惡性腫瘤組織中的FOLR1、MTRR蛋白表達(dá)情況；應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR檢測相同標(biāo)本中DHFR基因的表達(dá)情況,分析其與惡性卵巢腫瘤間的臨床病理及多藥耐藥的相關(guān)性。結(jié)果：(1) FOLR1、MTRR在正常卵巢組織,卵巢良性腫瘤和卵巢惡性腫瘤中的表達(dá)量依次增高(P0.05)；DHFR在正常卵巢組織,卵巢良性腫瘤和卵巢惡性腫瘤中的表達(dá)量依次降低(P0.05)。(2) FOLR1、MTRR在卵巢惡性腫瘤FIGO臨床分期中Ⅰ-Ⅱ期的表達(dá)量低于Ⅲ-Ⅳ期,在組織分級高分化中的表達(dá)量低于中低分化(P0.05)：DHFR在FIGO |臨床分期和組織分級表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。(3) FOLR1在鉑類藥物耐藥型卵巢惡性腫瘤中的表達(dá)量低于鉑類藥物敏感型(P0.05)；MTRR、DHFR在鉑類藥物耐藥型卵巢惡性腫瘤中的表達(dá)量高于鉑類藥物敏感型(P0.05)；FOLR1在治療后仍進(jìn)展腫瘤中的表達(dá)量低于緩解者(P0.05)；MTRR、DHFR在治療后仍進(jìn)展腫瘤中的表達(dá)量高于緩解者(P0.05)。(4) FOLRl在粘液性腫瘤中的表達(dá)量低于漿液性腫瘤(P0.05),在有淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移的卵巢惡性腫瘤中高于未有轉(zhuǎn)移者(P0.05),與患者的不同腫瘤病理分類、是否有大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移和腹水量多少無明顯相關(guān)(P0.05)；MTRR在漿液性腫瘤中的表達(dá)量高于粘液性腫瘤(P0.05),在有遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移的卵巢惡性腫瘤中高于未轉(zhuǎn)移者(P0.05),與患者是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、是否有大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移和腹水量無明顯相關(guān)(P0.05)；DHFR在漿液性腫瘤中的表達(dá)量高于粘液性腫瘤和內(nèi)膜樣腫瘤(P0.05),在有大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移的卵巢惡性腫瘤中低于未轉(zhuǎn)移者(P0.05),與患者是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、是否有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和腹水量無明顯相關(guān)(P0.05)。 (5)取FOLR1表達(dá)量界值為3.115時來判斷卵巢腫瘤性質(zhì),ROC曲線的Youden指數(shù)最大,卵巢惡性腫瘤FOLR1表達(dá)量的高低與中位生存時間差別無明顯相關(guān)(P0.05),COX模型多因素分析顯示FOLR1表達(dá)量不是影響患者生存預(yù)后的獨(dú)立因素；取MTRR表達(dá)量界值為0.618時來判斷卵巢腫瘤性質(zhì),ROC曲線的Youden指數(shù)最大,卵巢惡性腫瘤MTRR表達(dá)量的高低與中位生存時間差別無明顯相關(guān)(P0.05), COX模型多因素分析顯示MTRR表達(dá)量不是影響患者生存預(yù)后的獨(dú)立因素；取DHFR表達(dá)量界值為0.331時來判斷卵巢腫瘤性質(zhì),ROC曲線的Youden指數(shù)最大,卵巢惡性腫瘤DHFR表達(dá)量的高低與中位生存時間差別有相關(guān)性(P0.05),COX模型多因素分析顯示DHFR表達(dá)量是影響患者生存預(yù)后的獨(dú)立因素。結(jié)論：FOLR1在卵巢惡性腫瘤組織中的表達(dá)量高于正常卵巢和卵巢良性腫瘤,在鉑類藥物敏感型卵巢惡性腫瘤中FOLR1表達(dá)高于鉑類藥物耐藥型卵巢惡性腫瘤,提示FOLR1與卵巢惡性腫瘤多藥耐藥相關(guān)；MTRR在惡性卵巢腫瘤組織中的表達(dá)量高于正常卵巢和良性卵巢腫瘤,MTRR在鉑類藥物耐藥型卵巢惡性腫瘤中表達(dá)高于鉑類藥物敏感型；DHFR在卵巢惡性腫瘤中表達(dá)低于正常卵巢和卵巢良性腫瘤,DHFR在鉑類藥物耐藥型卵巢惡性腫瘤中呈高表達(dá),敏感型卵巢惡性腫瘤中低表達(dá)。提示三種酶可作為新型診斷標(biāo)志物有助于早期檢測卵巢惡性腫瘤,且其與惡性卵巢腫瘤鉑類耐藥關(guān)系密切新,對于判斷及預(yù)測惡性卵巢腫瘤多藥耐藥的發(fā)生發(fā)展有重要意義。第三章MTRR基因?qū)β殉采掀ば园㏒KOV3耐順鉑細(xì)胞的體內(nèi)外生物功能研究目的：構(gòu)建下調(diào)甲硫氨酸和酶還原酶(MTRR)的慢病毒載體并進(jìn)行鑒定。研究卵巢癌SKOV3/DDP細(xì)胞中MTRR基因表達(dá)下調(diào)后對其生物學(xué)功能的影響以及作用途徑。方法：篩選干擾效果最好的shRNA,鏈接至pSicoR載體質(zhì)粒,重組陽性克隆進(jìn)行測序鑒定,重組質(zhì)粒與其輔助質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞包裝病毒,病毒顆粒感染SKOV3/DDP細(xì)胞,流式分選,RT-PCR和Western Blot檢測MTRR的表達(dá)。MTT法測定三組細(xì)胞(SKOV3/DDP、shNC-SKOV3/DDP、shMTRR-SKOV3/DDP)的生長增值情況、順鉑對三組細(xì)胞的IC50和不同順鉑濃度分別作用不同時間三組細(xì)胞的生長曲線、克隆形成；流式細(xì)胞術(shù)檢測不同順鉑濃度作用48小后時對三組細(xì)胞周期分布的影響。結(jié)果：成功構(gòu)建了MTRR慢病毒干擾載體,能高效感染SKOV3/DDP細(xì)胞,轉(zhuǎn)然后MTRR基因穩(wěn)定下調(diào)。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞(shMTRR-SKOV3/DDP)與兩組對照組相比較：(1)順鉑對其作用的IC50值降低、增殖速度明顯降低。(2)順鉑對其生長抑制率增加(P0.05),MTRR干擾后SKOV3/DDP對順鉑的敏感性增加。(3)順鉑誘導(dǎo)后細(xì)胞阻滯于G0/G1期,其比例明顯增加(P'0.05)。結(jié)論：MTRR基因下調(diào)后能降低卵巢癌SKOV3/DDP細(xì)胞的增殖能力；SKOV3/DDP細(xì)胞中MTRR基因下調(diào)后細(xì)胞對順鉑的敏感性增加；MTRR基因下調(diào)后順鉑將其細(xì)胞阻滯在G0/G1期。第四章MTRR基因?qū)β殉采掀ば园㏒KOV3細(xì)胞多藥耐藥中的自噬和凋亡的影響及機(jī)制研究目的：探索MTRR基因下調(diào)后在順鉑耐藥的卵巢癌SKOV3細(xì)胞中凋亡和自噬的變化,以及對凋亡Caspase和Bcl-2家族以及PI3K-AKT1自噬通路的影響,為MTRR逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥提供可能的途徑,為臨床使用提供有利數(shù)據(jù)。方法：流式細(xì)胞術(shù)檢測不同順鉑濃度分別作用48小時誘導(dǎo)三組細(xì)胞的凋亡率；激光共聚焦檢測不同順鉑濃度作用48小后時對三組細(xì)胞LC3B分布的影響；Western Blot檢測一定順鉑濃度作用48小后時對三組細(xì)胞LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ、p62的影響；雷帕霉素在實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中誘導(dǎo)自噬,檢測順鉑作用后生存率和凋亡率改變；透射電鏡觀察三組細(xì)胞自噬體。一定濃度的順鉑(4μg/ml)對三組細(xì)胞(SKOV3/DDP、shNC-SKOV3/DDP、 shMTRR-SKOV3/DDP)進(jìn)行不同時間誘導(dǎo),并用使用免疫蛋白印跡(Western blot)方法檢測caspase和Bcl-2家族以及PI3K-AKT1自噬通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)和變化,得到蛋白表達(dá)發(fā)生變化的作用時間。再用一定濃度的順鉑對三組細(xì)胞作用一定時間,Western blot檢測關(guān)鍵蛋白,得出三組細(xì)胞問蛋白表達(dá)差異。結(jié)果：順鉑誘導(dǎo)后,激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞LC3B-Ⅱ,聚集減少；順鉑誘導(dǎo)后,Western Blot顯示細(xì)胞LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值降低,p62升高；雷帕霉素誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞后,.細(xì)胞在順鉑中的生存率升高,凋亡率降低；透射電鏡未見自噬體形成。三組細(xì)胞順鉑4μg/ml誘導(dǎo)三組細(xì)胞48小時后,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞(shMTRR-SKOV3/DDP)與兩組對照組相比較：(1)凋亡通路上Bax, cleaved caspase-9, cleaved caspase-3以及cleaved PARP顯著升高(P0.05),Bcl-2顯著降低(P0.05)。(2)自噬通路上p-AKT1和p-mTOR顯著上調(diào)(P0.05),而AKT1和mTOR無顯著變化。結(jié)論：在順鉑誘導(dǎo)下凋亡增加；MTRR基因下調(diào)能在SKOV3/DDP細(xì)胞中減弱順鉑誘導(dǎo)產(chǎn)生的自噬。MTRR下調(diào)通過影響激活caspase和Bcl-2凋亡家族以及抑制PI3K-AKT1自噬通路可增加順鉑耐藥細(xì)胞的敏感性,也我們進(jìn)一步研究卵巢癌耐藥發(fā)展過程中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路機(jī)制研究及其在臨床中的應(yīng)用提供了重要的指導(dǎo)意義。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.31

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本文編號：1735307