發(fā)布時間：2018-04-11 08:51

  本文選題：卵巢惡性腫瘤 + 多藥耐藥��； 參考：《廣西醫(yī)科大學》2015年博士論文

【摘要】：第一章 葉酸代謝酶類的表達與生物功能對卵巢惡性腫瘤多藥耐藥影響的研究進展(綜述)卵巢惡性腫瘤嚴重威脅婦女生命和健康,其發(fā)病率在婦科惡性腫瘤中居第三位,僅次于宮頸癌,宮體癌,而其死亡率居首位。卵巢癌發(fā)病隱匿,很多患者在出現(xiàn)癥狀之前已有腹腔轉(zhuǎn)移,確診時60%-70%患者已屬于晚期。目前公認的最佳治療方法以手術為主,輔以鉑類和紫杉醇聯(lián)合化療f一線化療),配合放療、生物學治療等,但至少有60%的患者最終出現(xiàn)獲得性耐藥,晚期患者五年生存率僅為30%-40%。卵巢癌多藥耐藥極大地影響了卵巢癌患者對化療的敏感性,是限制其臨床療效的主要原因。卵巢癌耐藥的產(chǎn)生過程是一個多因素、多基因、多途徑、多步驟的復雜過程,目前對于卵巢癌多藥耐藥產(chǎn)生機制的研究主要集中在耐藥相關基因及其表達產(chǎn)物的研究；耐藥有關酶類的研究；其他與耐藥相關物質(zhì)的研究。近年來對卵巢癌多藥耐藥的研究也取得新的進展,如卵巢癌細胞單層培養(yǎng)向三維培養(yǎng)的轉(zhuǎn)變：腫瘤微環(huán)境對耐藥產(chǎn)生的影響；腫瘤轉(zhuǎn)移對耐藥的影響等。但卵巢癌多藥耐藥機制極為復雜,目前尚未完全研究明確,卵巢癌多藥耐藥進一步研究,在臨床上預防耐藥、控制耐藥、逆轉(zhuǎn)耐藥,尋找高效低毒的新型藥物,已成為目前急需解決的問題。葉酸的參與脫氧核糖核酸合成和細胞內(nèi)甲基化反應,是體內(nèi)重要甲基供體,可以通過干擾DNA甲基化與合成化參與腫瘤發(fā)生發(fā)展。葉酸不能被人體直接利用,需一系列葉酸代謝酶類將其分解活化后才能在人體發(fā)揮生物學功能。因此葉酸代謝酶類能保持基因組的穩(wěn)定,影響體內(nèi)DNA合成和修復,以及正常甲基化,葉酸代謝酶活性的變化可導致DNA合成修復異常、甲基化異常、基因組不穩(wěn)定等,葉酸代謝酶基因多態(tài)性、葉酸缺乏或葉酸代謝障礙與腫瘤的形成關系密切。目前,葉酸代謝酶單核苷酸基因多態(tài)性在腫瘤的作用已是分子流行病學的研究熱點之一。FOLR1、MTRR和DHFR等是葉酸代謝通路中重要的酶,其活性的變化影響葉酸的正常代謝、脫氧核苷酸三磷酸鹽的生物合成以及DNA甲基化反應,進而在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展扮演重要角色。FOLR1是具有高親和力的葉酸受體,其位于細胞膜介導葉酸的胞吞途徑,有研究表明,FOLR1上皮來源的惡性組織中表達明顯增高,抑制FOLR1,細胞的化療敏感性得到增加；MTRR能維持甲硫氨酸合成酶的活性,在MTR活化過程中發(fā)揮重要作用,影響Hcy代謝和DNA甲基化,有研究表明,MTRR A66G使其活性降低后,能導致心血管疾病、畸形兒以及腫瘤的發(fā)生；DHFR能降解葉酸,使其變?yōu)樗臍淙~酸(即活性葉酸),四氫葉酸也就是甲基供體,有研究表明,DHFR表達增高能增加細胞的耐藥性。目前國內(nèi)外有許多調(diào)查研究了葉酸代謝酶與腫瘤之間的關系,但研究成果之間仍存在不少爭議。葉酸代謝酶作為一個極富前景的研究方向,其與卵巢癌發(fā)生發(fā)展、多藥耐藥之間的關系尚很不明確,值得我們進一步探索發(fā)現(xiàn)。第二章 FOLR1、MTRR和DHFR的表達對卵巢惡性腫瘤多藥耐藥中的臨床意義目的：研究卵巢惡性腫瘤組織中葉酸結合蛋白(FOLR1)、甲硫氨酸合成酶還原酶(MTRR)、二氫葉酸還原酶(DHFR)的表達及其臨床意義。方法：采用Western Blot檢測30例正常卵巢組織、50例卵巢良性腫瘤組織及80例卵巢惡性腫瘤組織中的FOLR1、MTRR蛋白表達情況；應用實時熒光定量PCR檢測相同標本中DHFR基因的表達情況,分析其與惡性卵巢腫瘤間的臨床病理及多藥耐藥的相關性。結果：(1) FOLR1、MTRR在正常卵巢組織,卵巢良性腫瘤和卵巢惡性腫瘤中的表達量依次增高(P0.05)；DHFR在正常卵巢組織,卵巢良性腫瘤和卵巢惡性腫瘤中的表達量依次降低(P0.05)。(2) FOLR1、MTRR在卵巢惡性腫瘤FIGO臨床分期中Ⅰ-Ⅱ期的表達量低于Ⅲ-Ⅳ期,在組織分級高分化中的表達量低于中低分化(P0.05)：DHFR在FIGO |臨床分期和組織分級表達差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。(3) FOLR1在鉑類藥物耐藥型卵巢惡性腫瘤中的表達量低于鉑類藥物敏感型(P0.05)；MTRR、DHFR在鉑類藥物耐藥型卵巢惡性腫瘤中的表達量高于鉑類藥物敏感型(P0.05)；FOLR1在治療后仍進展腫瘤中的表達量低于緩解者(P0.05)；MTRR、DHFR在治療后仍進展腫瘤中的表達量高于緩解者(P0.05)。(4) FOLRl在粘液性腫瘤中的表達量低于漿液性腫瘤(P0.05),在有淋巴結和遠處器官轉(zhuǎn)移的卵巢惡性腫瘤中高于未有轉(zhuǎn)移者(P0.05),與患者的不同腫瘤病理分類、是否有大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移和腹水量多少無明顯相關(P0.05)；MTRR在漿液性腫瘤中的表達量高于粘液性腫瘤(P0.05),在有遠處器官轉(zhuǎn)移的卵巢惡性腫瘤中高于未轉(zhuǎn)移者(P0.05),與患者是否淋巴結轉(zhuǎn)移、是否有大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移和腹水量無明顯相關(P0.05)；DHFR在漿液性腫瘤中的表達量高于粘液性腫瘤和內(nèi)膜樣腫瘤(P0.05),在有大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移的卵巢惡性腫瘤中低于未轉(zhuǎn)移者(P0.05),與患者是否淋巴結轉(zhuǎn)移、是否有遠處轉(zhuǎn)移和腹水量無明顯相關(P0.05)。 (5)取FOLR1表達量界值為3.115時來判斷卵巢腫瘤性質(zhì),ROC曲線的Youden指數(shù)最大,卵巢惡性腫瘤FOLR1表達量的高低與中位生存時間差別無明顯相關(P0.05),COX模型多因素分析顯示FOLR1表達量不是影響患者生存預后的獨立因素；取MTRR表達量界值為0.618時來判斷卵巢腫瘤性質(zhì),ROC曲線的Youden指數(shù)最大,卵巢惡性腫瘤MTRR表達量的高低與中位生存時間差別無明顯相關(P0.05), COX模型多因素分析顯示MTRR表達量不是影響患者生存預后的獨立因素；取DHFR表達量界值為0.331時來判斷卵巢腫瘤性質(zhì),ROC曲線的Youden指數(shù)最大,卵巢惡性腫瘤DHFR表達量的高低與中位生存時間差別有相關性(P0.05),COX模型多因素分析顯示DHFR表達量是影響患者生存預后的獨立因素。結論：FOLR1在卵巢惡性腫瘤組織中的表達量高于正常卵巢和卵巢良性腫瘤,在鉑類藥物敏感型卵巢惡性腫瘤中FOLR1表達高于鉑類藥物耐藥型卵巢惡性腫瘤,提示FOLR1與卵巢惡性腫瘤多藥耐藥相關；MTRR在惡性卵巢腫瘤組織中的表達量高于正常卵巢和良性卵巢腫瘤,MTRR在鉑類藥物耐藥型卵巢惡性腫瘤中表達高于鉑類藥物敏感型；DHFR在卵巢惡性腫瘤中表達低于正常卵巢和卵巢良性腫瘤,DHFR在鉑類藥物耐藥型卵巢惡性腫瘤中呈高表達,敏感型卵巢惡性腫瘤中低表達。提示三種酶可作為新型診斷標志物有助于早期檢測卵巢惡性腫瘤,且其與惡性卵巢腫瘤鉑類耐藥關系密切新,對于判斷及預測惡性卵巢腫瘤多藥耐藥的發(fā)生發(fā)展有重要意義。第三章MTRR基因?qū)β殉采掀ば园㏒KOV3耐順鉑細胞的體內(nèi)外生物功能研究目的：構建下調(diào)甲硫氨酸和酶還原酶(MTRR)的慢病毒載體并進行鑒定。研究卵巢癌SKOV3/DDP細胞中MTRR基因表達下調(diào)后對其生物學功能的影響以及作用途徑。方法：篩選干擾效果最好的shRNA,鏈接至pSicoR載體質(zhì)粒,重組陽性克隆進行測序鑒定,重組質(zhì)粒與其輔助質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細胞包裝病毒,病毒顆粒感染SKOV3/DDP細胞,流式分選,RT-PCR和Western Blot檢測MTRR的表達。MTT法測定三組細胞(SKOV3/DDP、shNC-SKOV3/DDP、shMTRR-SKOV3/DDP)的生長增值情況、順鉑對三組細胞的IC50和不同順鉑濃度分別作用不同時間三組細胞的生長曲線、克隆形成；流式細胞術檢測不同順鉑濃度作用48小后時對三組細胞周期分布的影響。結果：成功構建了MTRR慢病毒干擾載體,能高效感染SKOV3/DDP細胞,轉(zhuǎn)然后MTRR基因穩(wěn)定下調(diào)。實驗組細胞(shMTRR-SKOV3/DDP)與兩組對照組相比較：(1)順鉑對其作用的IC50值降低、增殖速度明顯降低。(2)順鉑對其生長抑制率增加(P0.05),MTRR干擾后SKOV3/DDP對順鉑的敏感性增加。(3)順鉑誘導后細胞阻滯于G0/G1期,其比例明顯增加(P'0.05)。結論：MTRR基因下調(diào)后能降低卵巢癌SKOV3/DDP細胞的增殖能力；SKOV3/DDP細胞中MTRR基因下調(diào)后細胞對順鉑的敏感性增加；MTRR基因下調(diào)后順鉑將其細胞阻滯在G0/G1期。第四章MTRR基因?qū)β殉采掀ば园㏒KOV3細胞多藥耐藥中的自噬和凋亡的影響及機制研究目的：探索MTRR基因下調(diào)后在順鉑耐藥的卵巢癌SKOV3細胞中凋亡和自噬的變化,以及對凋亡Caspase和Bcl-2家族以及PI3K-AKT1自噬通路的影響,為MTRR逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥提供可能的途徑,為臨床使用提供有利數(shù)據(jù)。方法：流式細胞術檢測不同順鉑濃度分別作用48小時誘導三組細胞的凋亡率；激光共聚焦檢測不同順鉑濃度作用48小后時對三組細胞LC3B分布的影響；Western Blot檢測一定順鉑濃度作用48小后時對三組細胞LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ、p62的影響；雷帕霉素在實驗組細胞中誘導自噬,檢測順鉑作用后生存率和凋亡率改變；透射電鏡觀察三組細胞自噬體。一定濃度的順鉑(4μg/ml)對三組細胞(SKOV3/DDP、shNC-SKOV3/DDP、 shMTRR-SKOV3/DDP)進行不同時間誘導,并用使用免疫蛋白印跡(Western blot)方法檢測caspase和Bcl-2家族以及PI3K-AKT1自噬通路關鍵蛋白的表達和變化,得到蛋白表達發(fā)生變化的作用時間。再用一定濃度的順鉑對三組細胞作用一定時間,Western blot檢測關鍵蛋白,得出三組細胞問蛋白表達差異。結果：順鉑誘導后,激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞LC3B-Ⅱ,聚集減少；順鉑誘導后,Western Blot顯示細胞LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值降低,p62升高；雷帕霉素誘導實驗組細胞后,.細胞在順鉑中的生存率升高,凋亡率降低；透射電鏡未見自噬體形成。三組細胞順鉑4μg/ml誘導三組細胞48小時后,實驗組細胞(shMTRR-SKOV3/DDP)與兩組對照組相比較：(1)凋亡通路上Bax, cleaved caspase-9, cleaved caspase-3以及cleaved PARP顯著升高(P0.05),Bcl-2顯著降低(P0.05)。(2)自噬通路上p-AKT1和p-mTOR顯著上調(diào)(P0.05),而AKT1和mTOR無顯著變化。結論：在順鉑誘導下凋亡增加；MTRR基因下調(diào)能在SKOV3/DDP細胞中減弱順鉑誘導產(chǎn)生的自噬。MTRR下調(diào)通過影響激活caspase和Bcl-2凋亡家族以及抑制PI3K-AKT1自噬通路可增加順鉑耐藥細胞的敏感性,也我們進一步研究卵巢癌耐藥發(fā)展過程中的信號轉(zhuǎn)導通路機制研究及其在臨床中的應用提供了重要的指導意義。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.31

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本文編號：1735307