本文選題：鹽酸石蒜堿　切入點(diǎn)：前列腺癌　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究背景前列腺癌(Prostate Cancer, Pca)是發(fā)生于前列腺上皮的惡性腫瘤,是老年男性常見的惡性腫瘤。在世界范圍內(nèi),前列腺癌發(fā)病率位于男性所有惡性腫瘤的第二位,死亡率居第六位,嚴(yán)重威脅人類生命健康。既往我國前列腺癌發(fā)病率相對較低,但隨著人口老齡化的加劇,生活環(huán)境的污染,飲食生活習(xí)慣的改變以及前列腺特異抗原篩查的逐步推廣,近年來其發(fā)病率逐漸增高。根據(jù)不同的病情,前列腺癌的治療方式包括主動監(jiān)測,根治性手術(shù)治療,外放射治療(External Beam Radiotherapy, EBRT),近距離照射治療,試驗(yàn)性前列腺癌局部治療及內(nèi)分泌治療等。目前內(nèi)分泌治療是治療早期前列腺癌的標(biāo)準(zhǔn)手段之一,然而在臨床中發(fā)現(xiàn),大多數(shù)患者經(jīng)內(nèi)分泌治療一段時間后便進(jìn)而發(fā)展為去勢抵抗性前列腺癌(Castrate-resistant Prostate Cancer, CRPC)表現(xiàn)出對雄激素阻斷不敏感,腫瘤惡性程度高。對于去勢抵抗性前列腺癌可采用化療。目前以Docetaxel(多西他賽)為基礎(chǔ)的化療已成為此類患者標(biāo)準(zhǔn)的一線化療方案,但大部分的化療藥物都表現(xiàn)出毒副作用較大,選擇性差或多藥耐藥等缺陷。近來,醋酸阿比特龍等新興藥物被證明對晚期前列腺癌有一定療效,但是這些藥物有效率不高,且高昂的花費(fèi)在一定程度限制了其在我國的臨床應(yīng)用。Sipuleucel-T (Provenge)是世界上第一種有效的治療去勢抵抗性前列腺癌的腫瘤疫苗,但同樣面臨上述治療費(fèi)用性價比的問題,因此有必要繼續(xù)研發(fā)一些安全、有效且花費(fèi)較低的藥物用于治療前列腺癌。目前,在開發(fā)抗腫瘤新藥方面,從天然植物中提取有效抗癌成分己經(jīng)成為一個重要研究方向。在抗腫瘤天然藥物的開發(fā)中,生物堿屬于目前研究較多的一個分支。生物堿是一類含氮的堿性有機(jī)化合物,有類似堿的化學(xué)性質(zhì),主要存在于自然界的動植物中。大多數(shù)生物堿有復(fù)雜的環(huán)狀結(jié)構(gòu),環(huán)內(nèi)多包含有氮元素,以此為基礎(chǔ)的結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出豐富的生理藥理活性。目前已探明的生物堿約有2000種左右,在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,把生物堿按照化學(xué)結(jié)構(gòu)分為七種類型,依次為吡啶類和哌啶類,有機(jī)胺類,吲哚類,莨菪烷類,甾體類,異喹啉類,萜類。石蒜堿屬于異喹啉類生物堿,為吡咯并菲啶的衍生物。石蒜堿是從石蒜科植物中分離得到的第一個生物堿,也是該科植物中最普遍的生物堿。石蒜堿具有多種生物藥理活性,現(xiàn)有的研究證明,石蒜堿具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎、抗瘧疾、抑制乙酰膽堿酯酶活性、抑制維生素生物合成以及保護(hù)心血管等作用。近年來,石蒜堿豐富的藥理、生理活性引起了生物醫(yī)藥研究領(lǐng)域的廣泛關(guān)注,有關(guān)石蒜堿及其衍生物的抗腫瘤作用及機(jī)制研究方面的報道呈上升趨勢。到目前為止,相當(dāng)一部分研究已證明石蒜堿對腫瘤細(xì)胞的生長抑制作用顯著高于其對正常細(xì)胞的生長抑制作用。石蒜堿對腫瘤的作用表現(xiàn)出廣譜性,現(xiàn)有研究揭示了石蒜堿及其衍生物對白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、食道癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等腫瘤顯示了不同程度的抑制作用。已有的研究揭示了石蒜堿抗腫瘤作用的復(fù)雜性,石蒜堿對前列腺癌細(xì)胞的殺傷作用是否存在其他機(jī)制尚未明確。因此有必要深入研究石蒜堿對前列腺癌細(xì)胞的影響,并探索可能存在的新機(jī)制。NF-kB是一種控制DNA轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞因子產(chǎn)生和細(xì)胞存活的蛋白質(zhì)復(fù)合物。NF-kB幾乎存在于所有類型的動物細(xì)胞中并參與細(xì)胞對諸多刺激的響應(yīng),這些刺激包括應(yīng)激、細(xì)胞因子、自由基、紫外線照射、氧化LDL及細(xì)菌或病毒抗原。在哺乳動物中,NF-kB家族由五個相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子：P50/NF-kB1、P52/NF-kB2、 REL/c-Re1、Rel-A/p65和Rel-B組成。這些轉(zhuǎn)錄因子均具有一個由300個氨基酸組成的N-末端DNA二聚域,稱為Rel同源結(jié)構(gòu)域(RHD)。通過RHD,NF-kB家庭成員可以形成同源和異源二聚體。RelA、c-Rel和RelB基因含有羧基端的轉(zhuǎn)錄激活域(TADS),這使他們能激活靶基因的表達(dá)。與此相反,p50和p52不含C-末端TADS;因此,p50和p52二聚體抑制轉(zhuǎn)錄,除非他們與含有TADS的蛋白質(zhì)如RelA、c-Re1、RelB或BCL-3(一個轉(zhuǎn)錄相關(guān)共激活因子)結(jié)合。NF-kB的轉(zhuǎn)錄活性受到存在于細(xì)胞質(zhì)中的IκB蛋白的抑制。目前有7個確定的IκB家庭成員,包括IkBα, IkBβ, Bcl-3, IkBε, IkBγ,以及前體蛋白P100和P105。當(dāng)NF-kB與IκB結(jié)合時,因NF-kB不能入核而不具備轉(zhuǎn)錄活性。當(dāng)IκB被磷酸化之后,NF-kB便可以解除IκB的抑制作用,進(jìn)入細(xì)胞核,調(diào)節(jié)相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄。大量的細(xì)胞因子,致癌劑,和腫瘤微環(huán)境都能通過相應(yīng)的信號通路活化NF-kB,從而調(diào)控下游蛋白的表達(dá),參與腫瘤的發(fā)生,進(jìn)展,侵襲,轉(zhuǎn)移等。研究證實(shí)NF-kB在多種惡性腫瘤中處于異常激活狀態(tài),而抑制NF-kB的活性可抑制多種腫瘤的進(jìn)展,提示NF-kB在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。NF-kB信號通路和前列腺癌關(guān)系密切,多項(xiàng)研究表明,NF-kB在一系列前列腺癌細(xì)胞系和前列腺癌動物模型中持續(xù)激活,在缺乏雄激素受體表達(dá)的前列腺癌細(xì)胞系PC-3,DU145中發(fā)現(xiàn)NF-kB高度活化。凋亡抑制因子(inhibitor of apoptosis proteins, IAPs)是一類高度保守的內(nèi)源性抗細(xì)胞凋亡因子家族,主要通過抑制Caspase活性和參與調(diào)解NF-kB的作用而抑制細(xì)胞凋亡。Survivin是IAP家族中的一個成員,具有抗細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和參與血管生成的作用。Survivin在分化成熟的正常組織中(胸腺和生殖腺除外)幾乎不表達(dá),而在大多數(shù)常見的惡性腫瘤組織高表達(dá)。美國國立癌癥研究中心對60種腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示Survivin在60種腫瘤細(xì)胞系中普遍高表達(dá),包括腎癌、前列腺癌、乳腺癌、肝癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病等。由以上結(jié)論可見Survivin和泌尿系腫瘤關(guān)系密切,研究發(fā)現(xiàn)Survivin在不同的前列腺癌細(xì)胞株均有表達(dá),表明Survivin在前列腺腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演一個重要的角色。研究還發(fā)現(xiàn)Survivin不僅在前列腺癌中高表達(dá),而且與前列腺癌的臨床分期、病理分級相關(guān)。綜上所述,前列腺癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢,NF-kB信號通路是前列腺癌中的重要信號通路,.石蒜堿表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性,目前尚未有研究探討鹽酸石蒜堿(Lycorine Hydrochloride, LH)通過NF-kB信號通路及其下游Survivin對前列腺癌細(xì)胞的影響,所以我們認(rèn)為有必要明確LH在前列腺癌細(xì)胞中的作用。本研究首先探討了LH對前列腺癌細(xì)胞中NF-kB信號通路的影響,隨后進(jìn)一步探討了LH對NF-kB信號通路下游靶標(biāo)Survivin的作用,最后通過細(xì)胞增殖、周期、凋亡、腫瘤克隆形成、腫瘤細(xì)胞遷移、裸鼠皮下成瘤等實(shí)驗(yàn)分析LH對前列腺癌細(xì)胞表型的影響。本論文可分為以下三章。第一章鹽酸石蒜堿抑制前列腺癌細(xì)胞NF-kB信號通路目的：鹽酸石蒜堿在多種腫瘤中發(fā)揮抑癌的作用,但目前尚沒有研究探索鹽酸石蒜堿對前列腺癌細(xì)胞NF-kB信號通路的作用。本研究擬探索鹽酸石蒜堿對前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3和22Rv1細(xì)胞內(nèi)NF-kB信號通路的影響。方法：分別用LH、BAY及LH+BAY作用于PC-3和22Rv1細(xì)胞48小時,用40ng/ml TNF-a刺激PC-3和22Rv1細(xì)胞株內(nèi)NF-kB信號通路,提取作用0min和15min后細(xì)胞總蛋白,用Western Blot檢測PC-3和22Rv1細(xì)胞內(nèi)NF-kB信號通路相關(guān)蛋白P-KKα/β、IKKα/β、P-P65、P65、P-IkBα、IkBα的表達(dá)情況。結(jié)果：與DMSO組相比,LH、BAY及LH+BAY作用后,PC-3和22Rv1細(xì)胞中P-IKKα/β、P-P65、P-IκBa蛋白表達(dá)量明顯下降。結(jié)論：鹽酸石蒜堿可以有效抑制前列腺癌PC-3和22Rv1細(xì)胞株內(nèi)NF-kB信號通路。第二章鹽酸石蒜堿抑制前列腺癌細(xì)胞中Survivin表達(dá)目的：探討鹽酸石蒜堿作用后對前列腺癌細(xì)胞內(nèi)NF-kB信號通路下游靶標(biāo)survivin的影響。方法：用2μg/ml LH、5μM BAY、10nM YM-155、2μg/ml LH+5μMBAY、2μg/ml LH+lOnM YM-155、5μM BAY+lOnM YM-155、2μg/ml LH+5μM BAY+10nMYM-155作用于PC-3細(xì)胞48h后,分別提取細(xì)胞總RNA和總蛋白,分別采用qPCR, Western Blot和免疫熒光檢測LH作用后對PC-3細(xì)胞內(nèi)survivin mRNA及蛋白表達(dá)水平的影響。結(jié)果：與DMSO對照組相比,2μg/ml LH、5μM BAY、10nM YM-155、2μg/ml LH+5μM BAY、2μg/ml LH+10nM YM-155、5μM BAY+10nM YM-155、2μg/ml LH+5μM BAY+10nM YM-155處理后,PC-3細(xì)胞內(nèi)survivin的表達(dá)在mRNA水平和蛋白水平均明顯下降(P0.05)。免疫熒光結(jié)果顯示：DMSO作用后,survivin在前列腺癌PC-3細(xì)胞中呈強(qiáng)熒光著色；而與DMSO組相比較,2μg/ml LH、5μM BAY、10nM YM-155、2μg/ml LH+5μM BAY、2μg/ml LH+lOnM YM-155、5μM BAY+lOnM YM-155、2μg/ml LH+5μM BAY+lOnM YM-155處理后,PC-3細(xì)胞內(nèi)熒光著色逐漸減弱。結(jié)論：鹽酸石蒜堿可以有效抑制前列腺癌PC-3細(xì)胞株內(nèi)NF-kB信號通路下游靶標(biāo)survivin的活性,且這種抑制作用在和BAY、YM-155聯(lián)和使用時具有協(xié)同效應(yīng)。第三章鹽酸石蒜堿對前列腺癌細(xì)胞表型的影響目的：探討鹽酸石蒜堿作用后對前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3和22Rv1細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。方法：以前列腺細(xì)胞株P(guān)C-3、22Rv1細(xì)胞為研究對象,實(shí)驗(yàn)處理組設(shè)為：①DMSO處理組；②LH處理組；③BAY處理組；④YM-155處理組；⑤LH+BAY聯(lián)合處理組(L+B)；⑥LH+YM-155聯(lián)合處理組(L+Y)；⑦BAY+YM-155聯(lián)合處理組(B+Y)；⑧LH+BAY+YM-155聯(lián)合處理組(L+B+Y)。分別作用于PC-3和22Rv1細(xì)胞24-48小時后,采用MTS研究LH對前列腺癌細(xì)胞體外增殖的影響；采用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)研究LH對前列腺細(xì)胞凋亡和周期的影響；采用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)研究LH對前列腺癌細(xì)胞體外克隆形成能力的影響；采用Transwell研究LH對前列腺癌細(xì)胞體外遷移能力的影響；同時建立裸鼠移植瘤模型,考察LH體內(nèi)抗前列腺癌的作用。結(jié)果：1、LH在干預(yù)后2、3、4、5d后明顯抑制PC-3和22Rv1細(xì)胞的增殖(P0.05),其對PC-3和22Rv1細(xì)胞的增殖抑制程度與BAY和YM-155的抑制程度相當(dāng)(P0.05)。同時,LH與BAY或YM-155聯(lián)用時,LH可加強(qiáng)BAY和YM-155對PC-3和22Rv1細(xì)胞增殖的抑制作用。2、LH對前列腺癌細(xì)胞凋亡的影響：LH可顯著促進(jìn)PC-3細(xì)胞及22Rv1細(xì)胞的凋亡(p0.05)。其誘導(dǎo)PC-3和22Rv1細(xì)胞凋亡程度與BAY和YM-155相當(dāng)(P0.05)。但是LH與BAY和YM-155聯(lián)用時可加強(qiáng)BAY和YM-155對PC-3和22Rv1細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。3、LH對前列腺癌細(xì)胞周期的影響：LH可顯著降低PC-3和22Rv1 S期細(xì)胞的比例(p0.05)。其效果與BAY和YM-155類似(P0.05)。但LH與BAY和YM-155聯(lián)用時,LH可顯著加強(qiáng)BAY和YM-155對22Rv1 S期細(xì)胞比例的降低作用(p0.05)。4、LH對前列腺癌細(xì)胞體外克隆形成能力的影響：與DMSO處理組相比,LH處理組的細(xì)胞克隆形成能力顯著降低(p0.05),而LH和BAY、YM-155處理組組間無差異(p0.05)。同時,與單藥處理組相比,兩藥聯(lián)合或三藥聯(lián)合處理組明顯降低PC-3和22Rv1細(xì)胞的克隆形成能力,表明LH可抑制前列腺癌細(xì)胞的體外克隆形成能力。5、LH對前列腺癌細(xì)胞體外遷移能力的影響：與對照組比較,2μg/ml LH、 5μM BAY、10nM YM-155、2μg/ml LH+5μM BAY、2μg/ml LH+10nM YM-155、 BAY+lOnM YM-155、2μg/ml LH+5μM BAY+10nM YM-155處理后PC-3細(xì)胞及22Rv1細(xì)胞穿過小室的數(shù)目均明顯減少(p0.05),同時與單藥處理組相比,兩藥聯(lián)合或三藥聯(lián)合處理組PC-3細(xì)胞穿過小室的數(shù)目均明顯減少(p0.05)。而LH、BAY和YM-155單藥處理組組間無差異(P0.05),L+B、L+Y和B+Y處理組組間無差異(p0.05)。表明LH可抑制前列腺癌細(xì)胞的遷移能力,同時LH與BAY和YM-155聯(lián)用時可獲得對前列腺癌細(xì)胞遷移能力更強(qiáng)的抑制作用。6、LH對前列腺癌細(xì)胞皮下成瘤能力的影響：與PBS對照組相比,LH和YM-155均能顯著抑制移植瘤的生長速度和腫瘤體積(p0.05),而LH注射組和YM-155注射組組間無差異(p0.05)。同時,與PBS對照組相比,LH和YM-155亦顯著抑制了腫瘤的重量(p0.05)。結(jié)論：LH可以通過抑制NF-κB及其下游靶標(biāo)Survivin的作用方式,抑制前列腺癌細(xì)胞增殖,促進(jìn)凋亡,阻滯細(xì)胞周期,降低細(xì)胞遷移能力,降低體內(nèi)成瘤能力,并且這種抑制作用在LH和BAY、YM-155聯(lián)和使用時具有協(xié)同效應(yīng)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.25

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本文編號：1722190