發(fā)布時間：2018-04-08 15:15

  本文選題：宮頸癌　切入點：宮頸上皮內(nèi)瘤變癌變　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：宮頸癌是全球第二大常見的婦科腫瘤,在發(fā)展中國家,宮頸癌的發(fā)病率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他國家,占世界總量的80%。由正常組織向?qū)m頸癌進(jìn)展會歷經(jīng)輕度不典型增生、中度不典型增生、重度不典型增生、原位癌、浸潤癌的過程。但宮頸上皮內(nèi)瘤變進(jìn)展為癌也不是必然的,一般認(rèn)為其癌變率約15-45%,絕大多數(shù)宮頸上皮內(nèi)瘤變可自愈。目前正因缺乏上皮內(nèi)病變惡性轉(zhuǎn)化的確切靶標(biāo),導(dǎo)致臨床常對宮頸上皮內(nèi)瘤變有過度治療。因此,篩選與鑒定可轉(zhuǎn)化為宮頸癌的這一類上皮內(nèi)病變的標(biāo)志物是宮頸癌研究領(lǐng)域的重要科學(xué)問題之一。微小RNA(micro RNA以下簡稱miRNA)是非常重要的非編碼調(diào)控分子,它介導(dǎo)調(diào)控多細(xì)胞生物基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后水平,且已被認(rèn)為是的一種普遍調(diào)節(jié)方式。研究證實有一半的miRNA基因位于癌癥相關(guān)基因區(qū)域,目前已證明許多miRNA與多種類型腫瘤的發(fā)生及發(fā)展相關(guān),且在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用。一些miRNA的功能丟失會引起腫瘤的發(fā)生,這類miRNA發(fā)揮著類似抑癌基因的功能,被稱為“TSmiRs”。另一類在癌癥中高表達(dá)的miRNA,能夠促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展,被稱為“oncomir”。miRNA由于其自身的特點,在腫瘤診斷和治療方面具有突出優(yōu)勢。其數(shù)量相對較少且分子小,檢測靈敏度較傳統(tǒng)的蛋白標(biāo)記物更高,因此適于建立快速便捷的臨床檢測方法。在治療方面,由于其分子小,體外合成方便,易于給藥,安全性相對較高。因此,以mirna與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展的相關(guān)性為切入點是一個全新的視野,作為腫瘤治療靶點它顯示出了巨大的潛能。我們首先通過mirna芯片分析了mirna在2例宮頸癌樣本及2例正常宮頸樣本中的表達(dá)情況,鑒定了一系列在宮頸癌中表達(dá)異常的mirna分子,其中多個是已知在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮促癌或抑癌作用的mirna。根據(jù)芯片結(jié)果,我們選擇了在宮頸癌樣本中顯著上調(diào)或下調(diào)的10個mirna分子(mir-10b,mir-193b,mir-23b,mir-29a,mir-375,mir-320a,mir-21,mir-9,mir-15a,mir-16),通過taqman探針實時定量pcr的方法檢測了這些mirna在40例宮頸癌及30例正常宮頸樣本中的表達(dá)情況,結(jié)果顯示mir-10b、mir-193b和mir-375在宮頸癌樣本中的表達(dá)量顯著低于正常宮頸上皮樣本,mir-320a、mir-21、mir-15a和mir-16在宮頸癌樣本中的表達(dá)量顯著高于正常宮頸上皮樣本。進(jìn)一步為了明確這些mirna在宮頸上皮內(nèi)瘤變進(jìn)展為癌的過程中可能發(fā)揮的作用,我們分別在30例輕度不典型增生、32例中度不典型增生、37例重度不典型增生、35例原位癌、40例浸潤宮頸癌樣本中檢測了mir-10b、mir-193b、mir-375、mir-320a、mir-21、mir-15a和mir-16的表達(dá)情況。結(jié)果顯示mir-10b在宮頸上皮內(nèi)瘤變進(jìn)展為癌的過程中逐漸下降,且差異顯著。mir-21在宮頸上皮內(nèi)瘤變進(jìn)展為癌的過程中逐漸上升,差異顯著。說明兩者可能在宮頸上皮病變?yōu)榘┑倪^程中發(fā)揮非常重要的作用,而且mir-10b的低表達(dá)與患者是否發(fā)生癌變顯著相關(guān),提示其作為早期宮頸癌診斷標(biāo)記物的可能性。進(jìn)一步我們檢測了mir-10b在宮頸癌發(fā)生中的作用。在宮頸癌細(xì)胞hela和siha中過表達(dá)mir-10b后,檢測細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲、細(xì)胞凋亡情況,發(fā)現(xiàn)mir-10b的過表達(dá)能夠?qū)m頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲進(jìn)行顯著抑制,同時對宮頸癌細(xì)胞的凋亡有促進(jìn)作用,提示其在宮頸癌發(fā)生過程中行使抑癌基因的功能。而在宮頸癌細(xì)胞hela和siha中抑制內(nèi)源mir-10b表達(dá)后,同樣檢測細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲、細(xì)胞凋亡情況,發(fā)現(xiàn)mir-10b的表達(dá)抑制能夠?qū)m頸癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲顯著促進(jìn),且對宮頸癌細(xì)胞的凋亡有抑制作用,說明mir-10b的顯著下調(diào)可能是宮頸癌發(fā)生的重要原因之一。為了進(jìn)一步探索mir-10b參與宮頸癌發(fā)生的具體機(jī)制,我們使用生物信息方法預(yù)測了mir-10b可能作用的靶基因,并構(gòu)建了多個含靶基因3’utr區(qū)的報告基因載體,結(jié)果顯示mir-10b的過表達(dá)能夠顯著抑制hoxa13’utr區(qū)的報告基因活性,且這種抑制作用依賴于hoxa13’utr區(qū)mir-10b的結(jié)合位點,進(jìn)一步的westernblot實驗顯示mir-10b的過表達(dá)能夠顯著抑制hoxa1的蛋白表達(dá),而mir-10b的抑制則能夠促進(jìn)hoxa1的蛋白表達(dá),說明hoxa1是mir-10b作用的直接靶基因。hoxa1在宮頸癌細(xì)胞中的功能實驗說明其能夠促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲等。進(jìn)一步的功能回復(fù)實驗也說明mir-10b確實是通過直接靶向hoxa1參與調(diào)控宮頸癌發(fā)生發(fā)展的。在多個宮頸癌樣品中檢測hoxa1表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)hoxa1在宮頸癌樣本中顯著上調(diào),且表達(dá)量與miR-10ba表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)。這些證據(jù)表明在宮頸癌發(fā)生過程中miR-10b顯著下調(diào),正是這種下調(diào)導(dǎo)致了其靶基因HOXA1的異常高表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)了宮頸癌的發(fā)生。那么miR-10b在宮頸癌中顯著下調(diào)的原因又是什么呢?已知DNA甲基化在基因沉默中具有重要作用,因此我們分析了miR-10b啟動子區(qū)甲基化情況,發(fā)現(xiàn)在大量宮頸癌樣本中miR-10b啟動子Cp G島均呈顯著的高甲基化狀態(tài),且宮頸癌細(xì)胞Hela和SiHa經(jīng)去甲基化酶處理后miR-10b表達(dá)水平顯著上升,說明DNA甲基化可能是miR-10b在宮頸癌中表達(dá)下調(diào)的重要原因。因此使用去甲基化酶治療宮頸癌可能激活多個抑癌miRNA的表達(dá),從而達(dá)到抑制腫瘤生長的作用。綜上所述,本研究工作鑒定了多個可能參與調(diào)控宮頸癌發(fā)生發(fā)展的miRNA分子,同時深入研究了miR-10b在宮頸癌發(fā)生中的作用及機(jī)制,豐富了宮頸癌發(fā)生的理論基礎(chǔ),同時為宮頸上皮內(nèi)瘤變癌變的監(jiān)控及干預(yù)提供新的思路和依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.33

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本文編號：1722165