本文選題：鋅　切入點：ZIP5　出處：《河北醫(yī)科大學》2017年碩士論文

【摘要】：第一部分在細胞水平探討不同鋅水平調控轉運蛋白SLC39A5(ZIP5)表達在食管癌發(fā)生發(fā)展中的機制研究目的:食管癌是常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率與死亡率均居高不下,嚴重威脅人類的健康。研究顯示,微量元素鋅的缺乏可能是食管癌的危險因素,SLC39A5(ZIP5)基因作為鋅離子轉運家族的一員,與體內的鋅水平密切相關;我們前期體外實驗發(fā)現(xiàn)正常鋅水平下,ZIP5基因表達異常導致食管癌細胞的功能發(fā)生改變。本實驗從細胞水平探討不同鋅水平與ZIP5基因表達的相互關系及其在食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用,為食管癌的臨床治療和人群防治提供新的方法與思路。方法:1利用RT-PCR、Western Blot方法驗證ZIP5基因在穩(wěn)轉食管癌細胞KYSE170空載體(KYSE170S)和ZIP5基因穩(wěn)定低表達(KYSE170K)兩種細胞中的表達水平;2采用低鋅濃度(Deficient)、正常鋅濃度(Normal)、25umol/l鋅濃度培養(yǎng)基培養(yǎng)KYSE170S和KYSE170K兩種細胞后進行相關實驗2.1 利用 RT-PCR、Western Blot 方法檢測 ZIP5 基因在 KYSE170S 和KYSE170K兩種細胞中的表達水平;2.2 利用 MTS(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium)細胞比色法、平板克隆形成實驗(colony-forming unit assays)、、流式鄉(xiāng)細胞術(Flow Cytometry,FCM)、Transwell實驗、劃痕實驗(scratchtest)檢測KYSE170S和KYSE170K兩種細胞在不同鋅水平培養(yǎng)下的增殖、侵襲和徖移功能。結果:1 ZIP5穩(wěn)轉細胞驗證:RT-PCR、Western Blot方法結果顯示,與KYSE170S細胞相比,ZIP5基因在KYSE170K中的表達量分別降低了 37.5%、22.0%,兩者相比均有統(tǒng)計學差異,驗證了 ZIP5在KYSE170K細胞中低表達。2不同鋅濃度培養(yǎng)KYSE170S和KYSE170K兩種細胞時進行的相關實驗2.1不同鋅水平培養(yǎng)KYSE170S和KYSE170K兩種細胞時ZIP5表達情況2.1.1不同鋅水平培養(yǎng)兩種細胞時ZIP5表達情況:低鋅水平下培養(yǎng)兩種細胞時,RT-PCR方法結果顯示,ZIP5基因在KYSE170S細胞和KYSE170K細胞中表達量分別為0.25±0.01、0.14±0.02;兩者相比有統(tǒng)計學差異。Western Blot方法結果顯示,ZIP5基因在KYSE170S細胞和KYSE170K細胞中表達量分別為0.68±0.01、0.50±0.02;兩者相比有統(tǒng)計學差異。25umol/l鋅濃度下培養(yǎng)兩種細胞時,RT-PCR方法結果顯示,ZIP5基因在KYSE170S細胞和KYSE170K細胞中表達量分別為0.16±0.04、0.11±0.01;兩者相比有統(tǒng)計學差異。WesternBlot方法結果顯示,ZIP5基因在KYSE170S細胞和KYSE170K細胞中表達量分別為0.62±0.02、0.42±0.04;兩者相比有統(tǒng)計學差異。結果說明低鋅水平和25umol/l鋅濃度培養(yǎng)時,ZIP5基因在KYSE170S細胞中的表達量均高于KYSE170K細胞。2.1.2同種細胞不同鋅水平培養(yǎng)時ZIP5表達情況:KYSE170S細胞在不同鋅水平培養(yǎng)下,RT-PCR方法、WesternBlot方法結果顯示,ZIP5基因表達量在低鋅水平、正常鋅水平、25umol/l鋅水平分別為0.25±0.01、0.17±0.02、0.16±0.04;低鋅水平與正常鋅水平、25umol/l鋅水平相比均有統(tǒng)計學差異。Western Blot方法結果與RT-PCR方法結果相同。KYSE170K細胞在不同鋅水平培養(yǎng)下時,RT-PCR、Western Blot方法結果顯示,ZIP5基因表達量在低鋅水平、正常鋅水平、25umol/l 鋅水平分別為 0.14±0.02、0.10±0.01、0.11±0.01;低鋅水平與正常鋅水平、25umol/l鋅水平相比均有統(tǒng)計學差異。Western Blot方法結果與RT-PCR方法結果相同。結果說明ZIP5基因在KYSE170S和KYSE170K細胞中表達量隨著培養(yǎng)基中鋅水平的減少而升高。2.2不同鋅水平培養(yǎng)KYSE170S和KYSE170K兩種細胞時,細胞增殖功能變化情況2.2.1不同鋅水平培養(yǎng)兩種細胞時細胞增殖功能變化情況:正常鋅濃度培養(yǎng)兩種細胞時,MTS結果顯示,KYSE170S細胞在Oh、24h、48h、72h、96h 時的 OD 值分別為 0.35±0.09、0.64±0.02、0.92±0.02、1.27±0.02、1.68±0.04;KYSE170K 細胞的 OD 值分別為 0.34±0.02、0.40±0.01、0.65±0.02、0.85±0.01、1.19±0.38。兩兩比較結果表明,細胞生長 24h、48h、72h、96h 后,KYSE170S 細胞與 KYSE170K細胞的增殖情況均有統(tǒng)計學差異。低鋅培養(yǎng)兩種細胞時,MTS結果顯示,KYSE170S細胞在Oh、24h、48h、72hh時的OD值分別為0.38±0.05、0.67±0.02、0.95±0.02、1.22±0.16、1.75±0.01;KYSE170K細胞的 OD 值分別為 0.38±0.01、0.36±0.08、0.72±0.10、0.82±0.01、1.23±0.14。兩兩比較結果表明,細胞生長24h、48h、72h、96h后,KYSE170S細胞與KYSE170K細胞的增殖情況均有統(tǒng)計學差異。結果說明無論是正常鋅水平還是低鋅水平培養(yǎng)時,KYSE170S細胞的增殖速度均大于KYSE170K細胞。2.2.2同種細胞不同鋅水平培養(yǎng)時,KYSE170S細胞和KYSE170K細胞在低鋅水平和正常鋅水平培養(yǎng)下細胞的增殖能力均無統(tǒng)計學差異。2.3不同鋅水平培養(yǎng)KYSE170S和KYSE170K兩種細胞時,細胞平板克隆形成情況2.3.1不同鋅水平培養(yǎng)兩種細胞時,細胞平板克隆形成情況:正常鋅濃度培養(yǎng)時,平板克隆實驗結果顯示,KYSE170S細胞與KYSE170K細胞的克隆形成率分別為21.5%、16.2%;兩者相比有統(tǒng)計學差異。低鋅培養(yǎng)兩種細胞時,平板克隆實驗結果顯示,KYSE170S細胞與KYSE170K細胞的克隆形成率分別為23.5%、18.1%;兩者相比有統(tǒng)計學差異。結果說明無論是正常鋅水平還是低鋅水平培養(yǎng)時,KYSE170S細胞的克隆形成速度均大于KYSE170K細胞。2.3.2同種細胞不同鋅水平培養(yǎng)時,KYSE170S細胞和KYSE170K細胞的克隆形成率均無統(tǒng)計學差異。2.4不同鋅水平培養(yǎng)KYSE170S和KYSE170K兩種細胞時,細胞周期變化情況2.4.1不同鋅水平培養(yǎng)兩種細胞時細胞周期變化情況:正常鋅濃度培養(yǎng)兩種細胞時,流式細胞術結果顯示,KYSE170S和KYSE170K兩種細胞的G0/G1百分比分別為32.98±1.02、26.24±0.65;兩者相比有統(tǒng)計學差異。低鋅培養(yǎng)兩種細胞時,KYSE170S和KYSE170K兩種細胞的G0/G1百分比分別為43.56±0.69、29.94±0.57;兩者相比有統(tǒng)計學差異。結果說明無論是正常鋅水平還是低鋅水平培養(yǎng)時,KYSE170S細胞的細胞周期變化速度均大于KYSE170K細胞。2.4.2同種細胞不同鋅水平培養(yǎng)時細胞周期變化情況:不同鋅水平培養(yǎng)KYSE170S細胞時,流式細胞術結果顯示,正常鋅水平和低鋅水平下G0/G1百分比分別為32.98±1.02、43.56±0.69,兩者相比有統(tǒng)計學差異。不同鋅水平培養(yǎng)KYSE170K細胞時,流式細胞術結果顯示,正常鋅水平和低鋅水平下G0/G1百分比分別為26.24±0.65、29.94±0.57,兩者相比也有統(tǒng)計學差異。說明隨著細胞培養(yǎng)鋅水平的增加,KYSE170S細胞和KYSE170K細胞的細胞周期變化速度均降低。2.5不同鋅水平培養(yǎng)KYSE170S和KYSE170K兩種細胞時,細胞侵襲能力變化情況2.5.1不同鋅水平培養(yǎng)兩種細胞時細胞侵襲能力變化情況:正常鋅濃度培養(yǎng)兩種細胞時,Transwell實驗結果顯示,KYSE170S細胞與KYSE170K細胞的穿透比分別為0.50±0.07、0.44±0.03;兩者相比有統(tǒng)計學差異。低鋅培養(yǎng)兩種細胞時,Transwell實驗結果顯示,KYSE170S細胞與KYSE170K細胞的穿透比分別為0.63±0.01、0.54±0.02;兩者相比有統(tǒng)計學差異。結果說明無論是正常鋅水平還是低鋅水平培養(yǎng)時,KYSE170S細胞的侵襲能力均高于KYSE170K細胞。2.5.2同種細胞不同鋅水平培養(yǎng)時細胞侵襲能力變化情況:不同鋅水平培養(yǎng)KYSE170S細胞時,Transwell實驗結果顯示,正常鋅水平和低鋅水平下KYSE170S細胞穿透比分別為0.50±0.07、0.63±0.01,兩者相比有統(tǒng)計學差異。不同鋅水平培養(yǎng)KYSE170K細胞時,Transwell實驗結果顯示,正常鋅水平和低鋅水平下KYSE170K細胞穿透比分別為0.44±0.03、0.54±0.02,兩者相比有統(tǒng)計學差異。說明隨著細胞培養(yǎng)基中鋅水平的增加,KYSE170S細胞和KYSE170K細胞的侵襲能力均減弱。2.6不同鋅水平培養(yǎng)KYSE170S和KYSE170K兩種細胞時,細胞遷移能力變化情況2.6.1不同鋅水平培養(yǎng)兩種細胞時細胞遷移能力變化情況:正常鋅濃度培養(yǎng)兩種細胞時,劃痕24h后,KYSE170S細胞與KYSE170K細胞的遷移面積分別減小為原來的0.43±0.06、0.72±0.14;兩者相比有統(tǒng)計學差異。低鋅培養(yǎng)兩種細胞時,劃痕實驗結果顯示,劃痕24h后,KYSE170S細胞與KYSE170K細胞的遷移面積分別減小為原來的0.38±0.09、0.49±0.09,兩者相比有統(tǒng)計學差異。結果說明無論是正常鋅還是低鋅培養(yǎng)時,KYSE170S細胞的遷移能力均大于KYSE170K細胞。2.6.2同種細胞不同鋅水平培養(yǎng)時細胞侵襲能力變化情況:不同鋅水平培養(yǎng)KYSE170S細胞時,劃痕實驗結果顯示,正常鋅水平和低鋅水平下遷移面積分別減小為原來的0.43±0.06、0.38±0.09,兩者相比有統(tǒng)計學差異。不同鋅水平培養(yǎng)KYSE170K細胞時,劃痕實驗結果顯示,正常鋅水平和低鋅水平下遷移面積分別減小為原來的0.72±0.14、0.49±0.09,兩者相比有統(tǒng)計學差異。說明隨著細胞培養(yǎng)基中鋅水平的增加,KYSE170S細胞和KYSE170K細胞的侵襲能力均減弱。第二部分在整體水平探討不同鋅水平調控轉運蛋白SLC39A5(ZIP5)表達在食管癌發(fā)生發(fā)展中的機制研究目的:據報道,營養(yǎng)元素鋅的攝入不足可能是高發(fā)區(qū)食管癌的危險因素。我們的前期裸鼠荷瘤實驗結果發(fā)現(xiàn),正常鋅水平時,沉默ZIP5基因會影響食管癌的發(fā)生發(fā)展。本實驗從動物水平探討不同鋅水平與ZIP5基因表達的相互關系及其在食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用,旨在探討不同鋅離子濃度調控ZIP5基因表達及其在食管癌中的發(fā)生發(fā)展機制,為食管癌的臨床治療和人群防治提供新的方法與思路。方法:1 通過 4-Nitroquinoline 1-oxide(4NQO)飲水法建立 C57BL/6 野生型(Wild type,WT)小鼠和 ZIP5 基因敲除(Knock Genotype,KO)小鼠的食管癌模型,誘癌過程采用低鋅(Deficiency of zinc,DZ)飼料、正常鋅(Normal concentration of zinc,NZ)飼料、低鋅后正常鋅(Supplement of zinc,SZ)飼料喂養(yǎng)兩組小鼠。2實驗小鼠誘癌過程中及誘癌成功后相關實驗2.1利用HE染色檢測上述三組不同鋅水平喂養(yǎng)的WT小鼠和KO小鼠食管癌的誘癌成功率。2.2利用電感耦合等離子體質譜法檢測低鋅飼料、正常鋅飼料喂養(yǎng)的WT小鼠和KO小鼠毛發(fā)、血液中的鋅水平;2.3利用RT-PCR、免疫組化方法檢測COX-2,STAT3和E-cadherin基因在正常鋅飼料喂養(yǎng)的WT小鼠和KO小鼠食管癌中的表達。結果:1 WT小鼠與KO小鼠誘癌模型建立1.1通過4NQO飲水法建立食管癌模型結果顯示,正常鋅飼料喂養(yǎng)時,WT小鼠與KO小鼠的誘癌成功率分別是45.1%、9.5%,兩者相比有統(tǒng)計學差異。補充鋅飼料喂養(yǎng)時兩者的誘癌成功率分別是59.2%、26.9%,兩者相比有統(tǒng)計學差異。低鋅飼料喂養(yǎng)時兩者的誘癌成功率分別是90.6%、46.2%,兩者相比有統(tǒng)計學差異。結果說明相同鋅水平喂養(yǎng)小鼠時,WT小鼠的誘癌成功率均高于KO小鼠。1.2不同鋅水平飼料喂養(yǎng)小鼠時,誘癌結果顯示,WT小鼠的誘癌成功率兩兩相比均有統(tǒng)計學差異。不同鋅水平飼料喂養(yǎng)小鼠時,誘癌結果顯示,KO小鼠的誘癌成功率兩兩相比亦均有統(tǒng)計學差異。結果說明隨著喂養(yǎng)鋅水平的降低,WT小鼠與KO小鼠的誘癌成功率均升高。2不同組實驗小鼠毛發(fā)鋅水平檢測結果2.1短期(12天)不同鋅水平飼料喂養(yǎng)小鼠時,其毛發(fā)鋅水平檢測結果(mg/Kg)2.1.1短期(12天)正常鋅水平飼料喂養(yǎng)小鼠時,WT小鼠與KO小鼠的毛發(fā)鋅含量分別為236.12±39.08、183.99±41.73;兩者相比無統(tǒng)計學差異。低鋅飼料喂養(yǎng)時兩者的毛發(fā)鋅含量分別為217.38±34.38、131.26±20.62;兩者相比無統(tǒng)計學差異。結果說明短期(12天)低鋅飼料喂養(yǎng)時,WT小鼠與KO小鼠毛發(fā)鋅含量無差別。2.1.2短期(12天)不同鋅水平飼料喂養(yǎng)小鼠時,WT小鼠毛發(fā)鋅含量無統(tǒng)計學差異;KO小鼠用不同鋅水平飼料喂養(yǎng)時,其毛發(fā)鋅含量亦無統(tǒng)計學差異。其余不同實驗小鼠不同實驗材料中鋅含量均無統(tǒng)計學差異。2.2長期(28周)不同鋅水平飼料喂養(yǎng)小鼠時,其毛發(fā)鋅水平檢測結果(mg/Kg)2.2.1長期(28周)正常鋅水平飼料喂養(yǎng)小鼠時,WT小鼠與KO小鼠的毛發(fā)鋅含量分別為144.07±0.58、129.22±5.61;兩者相比無統(tǒng)計學差異。低鋅飼料喂養(yǎng)時兩者的毛發(fā)鋅含量分別為123.76±2.65、107.19±5.26;兩者相比有統(tǒng)計學差異。結果說明長期(28周)低鋅飼料喂養(yǎng)時,WT小鼠毛發(fā)鋅含量高于KO小鼠。2.2.2長期(28周)不同鋅水平飼料喂養(yǎng)小鼠時,WT小鼠毛發(fā)鋅含量有統(tǒng)計學差異;KO小鼠用不同鋅水平飼料喂養(yǎng)時,其毛發(fā)鋅含量亦有統(tǒng)計學差異。其余不同實驗小鼠不同實驗材料中鋅含量均無統(tǒng)計學差異。3正常鋅喂養(yǎng)WT小鼠與KO小鼠食管癌中COX-2,STAT3和E-cadherin基因的表達情況正常鋅喂養(yǎng)WT小鼠與KO小鼠食管癌RT-PCR實驗結果顯示,WT小鼠與KO小鼠食管癌中COX-2基因的表達水平分別是0.62±0.17、0.19±0.14,兩者相比有統(tǒng)計學差異。WT小鼠與KO小鼠食管癌中STAT3基因的表達水平分別是0.20±0.01、0.11±0.04,兩者相比有統(tǒng)計學差異。WT小鼠與KO小鼠食管癌中E-cadherin基因的表達水平分別是0.04±0.02、0.50±0.28,兩者相比有統(tǒng)計學差異。正常鋅喂養(yǎng)WT小鼠與KO小鼠食管癌免疫組化實驗結果顯示,WT小鼠與KO小鼠食管癌中COX-2基因的表達水平分別是9.30±0.29、4.02±0.30,兩者相比有統(tǒng)計學差異。WT小鼠與KO小鼠食管癌中STAT3基因的表達水平分別是6.35±0.29、1.17±0.24,兩者相比有統(tǒng)計學差異。WT小鼠與KO小鼠食管癌中E-cadherin基因的表達水平分別是2.35±0.29、6.27±0.38,兩者相比有統(tǒng)計學差異。結果說明COX-2,STAT3基因在WT小鼠食管癌中的表達量均高于KO小鼠;E-cadherin基因在WT小鼠食管癌中的表達量低于KO小鼠。結論:1鋅水平下降時,食管癌KYSE170S細胞和KYSE170K細胞的增殖、侵襲和遷移能力均升高。在低鋅與正常鋅水平下,ZIP5表達下調均導致食管癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力降低。2膳食鋅水平降低時,動物誘癌模型中食管癌發(fā)生率升高;膳食鋅水平降低、正常或得到補充時,與野生型小鼠相比,ZIP5基因敲除小鼠的食管癌發(fā)生率降低。3動物誘癌模型顯示,相同膳食鋅水平時,ZIP5基因表達下調抑制了 COX-2和STAT3分子的表達,減弱了對E-cadherin基因的抑制作用,導致E-cadherin基因的表達上調,進而促進了食管癌的發(fā)生發(fā)展。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.1

【參考文獻】

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本文編號：1721743