本文選題：慢性粒細胞白血病　切入點：YAP　出處：《重慶醫(yī)科大學》2016年博士論文

【摘要】：慢性粒細胞白血病(Chronic myeloid leukemia,CML)是一類起源于骨髓造血干祖細胞的惡性克隆增殖性疾病。由9號染色體和22號染色體易位形成的bcr/abl融合基因在該病的發(fā)生和進展過程中發(fā)揮著重要的作用。該融合基因所表達的BCR/ABL融合蛋白具有持續(xù)性激活的酪氨酸激酶活性,可激活下游多條信號通路并導致髓系細胞的惡性增殖。Hippo通路是在果蠅體內發(fā)現的一條信號轉導通路,其主要功能是通過促進細胞凋亡和限制細胞過度增殖進而調控器官體積、保持細胞增殖凋亡平衡并參與調節(jié)細胞的接觸性抑制等。YAP是該通路關鍵的效應因子,它作為一種轉錄輔因子,可與TEAD和Smad等多種轉錄因子結合,從而調控下游c-myc和survivin等基因的表達。YAP表達和定位的異常與多種腫瘤的發(fā)生及惡性程度相關。雖然YAP在調節(jié)細胞增殖與凋亡方面發(fā)揮著重要的作用,并且其靶基因c-myc和survivin與CML的急變及患者的預后密切相關,但是在CML這種惡性血液系統(tǒng)疾病中該蛋白的表達及作用機制尚不清楚。本課題擬從檢測CML病人與正常對照以及BCR/ABL-與BCR/ABL+細胞株中YAP的表達差異入手,初步探討YAP是否受BCR/ABL的調節(jié),并在此基礎上分析靶向抑制YAP對CML細胞株生物學效應及k562細胞致小鼠白血病成瘤能力的影響及其機制。旨在為cml的靶向治療提供新的思路。主要研究方法:1.分別檢測不同時期cml患者(cp、ap以及bp)和正常對照(n)組骨髓單個核細胞標本中yap蛋白的表達情況,初步了解yap與cml的關系;檢測bcr/abl-細胞株(hl60、thp1、nb4)、bcr/abl+細胞株(k562、kcl22、k562/g01)、p210bcr/abl轉化前(baf3、32d)和轉化后細胞株(bp210、32dp210)中yap的mrna和蛋白水平,了解bcr/abl與yap的關系;用im處理cml細胞株k562和k562/g01,研究抑制bcr/abl激酶活性對yap表達、定位、蛋白穩(wěn)定性以及其下游靶基因c-myc和survivin表達的影響;分別使用bcr/abl下游通路(mek-erk和pi3k/akt信號通路)的抑制劑u0126、pd98059和ly294002處理細胞,初步探討bcr/abl調節(jié)yap的機制。2.分別采用小干擾rna和小分子抑制劑維替泊芬(verteporfin,vp)處理兩種方法,抑制k562和k562/g01細胞中yap功能的發(fā)揮,同時聯合im與vp,通過體外實驗觀察對cml細胞生物學效應的影響及作用機制。分別通過mtt實驗檢測細胞增殖情況;流式細胞術(flowcytometer,fcm)分析對細胞周期和凋亡的影響;瑞氏染色觀察細胞形態(tài)變化;westernblot檢測下游基因c-myc,survivin以及細胞周期和凋亡相關蛋白的表達。3.構建k562-nod/scid小鼠血液瘤模型,觀察對照組、im、vp以及im聯合vp處理組小鼠的一般情況、外周血中wbc、cd45+白血病細胞的百分率以及生存期;對出現明顯發(fā)病癥狀的瀕死期小鼠進行頸椎脫臼法處死,觀察小鼠肝、脾、肺等臟器的大小并拍照,記錄各臟器重量;4%多聚甲醛固定后,石蠟包埋,切片,he染色觀察肝、脾等組織中白血病細胞的浸潤情況;瑞氏染色觀察骨髓象的變化;定量pcr檢測骨髓細胞中c-myc和survivin的mrna水平的變化。實驗結果與結論:1.在cml患者骨髓單個核細胞中yap蛋白水平明顯高于正常對照組;bcr/abl+細胞株(k562、kcl22、k562/g01)中yap的蛋白表達明顯高于bcr/abl-細胞株(hl60、thp1、nb4);與baf3、32d相比,p210bcr/abl轉化細胞株bp210和32dp210中yap的蛋白表達明顯增高但是mrna水平無明顯差異;bcr/abl抑制劑im能夠下調yap的蛋白水平,但是對mrna無影響;im能夠通過泛素蛋白酶體途徑加快yap的降解并且能夠減少yap的入核,從而抑制其下游靶基因c-myc和survivin的表達;mek-erk信號通路的抑制劑u0126可以降低yap的蛋白水平。2.在cml細胞株k562和k562/g01中,采用sirna技術干擾yap的表達,可以抑制細胞的增殖,促進細胞的凋亡,同時使細胞周期阻滯于g1期。并能夠明顯抑制hippo通路下游c-myc和survivin的表達,下調周期相關蛋白cyclind1的表達,上調p21和bax的表達,同時使凋亡相關蛋白parp及caspase3的活化增多。另外,使用yap-tead的小分子抑制劑vp處理k562和k562/g01,同樣能夠抑制細胞增殖、促進細胞凋亡、將細胞周期阻滯于G1期,并且VP與IM聯合應用能夠增強IM的作用。3.在K562-NOD/SCID小鼠模型中,與對照組相比,IM和VP單獨處理組及聯合處理組小鼠的發(fā)病時間及生存期明顯延長,體重減輕和外周血白細胞增高的速度減慢,肝脾腫大及白血病細胞浸潤情況有明顯改善,并且聯合處理組作用最為明顯,骨髓細胞中c-myc和survivin的mRNA水平有所降低。綜上所述,本課題發(fā)現YAP蛋白在CML患者骨髓單個核細胞中的表達高于正常對照組;BCR/ABL+細胞株中YAP的蛋白表達明顯高于BCR/ABL-細胞株;BCR/ABL通過影響YAP的蛋白穩(wěn)定性及細胞定位參與了對YAP蛋白水平的調節(jié),其下游的MEK-ERK信號通路可能參與了該過程;體外抑制YAP能夠通過下調c-Myc、survivin和cyclinD1,上調p21、Bax、cleaved-caspase3及cleaved-PARP的水平,抑制CML細胞的增殖并促進細胞凋亡;YAP抑制劑VP能明顯延長K562-NOD/SCID模型小鼠的發(fā)病時間及生存期。本課題的意義在于:首次在CML中研究了YAP蛋白的表達并初步探討了BCR/ABL對YAP的調節(jié)機制,通過體內外實驗研究YAP對CML細胞的生物學效應的影響及相關機制,為CML的治療提供了一個新的靶點,同時也為臨床聯合用藥奠定了一定的理論基礎。
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【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R733.72

【參考文獻】

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1 齊靜,彭暉,顧振綸,梁中琴,楊純正;伊馬替尼耐藥的K562細胞系的建立及其生物學特性研究[J];中華血液學雜志;2004年06期

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本文編號：1711048