發(fā)布時(shí)間：2018-04-04 17:56

  本文選題：慢性粒細(xì)胞白血病　切入點(diǎn)：YAP　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：慢性粒細(xì)胞白血病(Chronic myeloid leukemia,CML)是一類起源于骨髓造血干祖細(xì)胞的惡性克隆增殖性疾病。由9號(hào)染色體和22號(hào)染色體易位形成的bcr/abl融合基因在該病的發(fā)生和進(jìn)展過程中發(fā)揮著重要的作用。該融合基因所表達(dá)的BCR/ABL融合蛋白具有持續(xù)性激活的酪氨酸激酶活性,可激活下游多條信號(hào)通路并導(dǎo)致髓系細(xì)胞的惡性增殖。Hippo通路是在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,其主要功能是通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡和限制細(xì)胞過度增殖進(jìn)而調(diào)控器官體積、保持細(xì)胞增殖凋亡平衡并參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的接觸性抑制等。YAP是該通路關(guān)鍵的效應(yīng)因子,它作為一種轉(zhuǎn)錄輔因子,可與TEAD和Smad等多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合,從而調(diào)控下游c-myc和survivin等基因的表達(dá)。YAP表達(dá)和定位的異常與多種腫瘤的發(fā)生及惡性程度相關(guān)。雖然YAP在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與凋亡方面發(fā)揮著重要的作用,并且其靶基因c-myc和survivin與CML的急變及患者的預(yù)后密切相關(guān),但是在CML這種惡性血液系統(tǒng)疾病中該蛋白的表達(dá)及作用機(jī)制尚不清楚。本課題擬從檢測(cè)CML病人與正常對(duì)照以及BCR/ABL-與BCR/ABL+細(xì)胞株中YAP的表達(dá)差異入手,初步探討YAP是否受BCR/ABL的調(diào)節(jié),并在此基礎(chǔ)上分析靶向抑制YAP對(duì)CML細(xì)胞株生物學(xué)效應(yīng)及k562細(xì)胞致小鼠白血病成瘤能力的影響及其機(jī)制。旨在為cml的靶向治療提供新的思路。主要研究方法:1.分別檢測(cè)不同時(shí)期cml患者(cp、ap以及bp)和正常對(duì)照(n)組骨髓單個(gè)核細(xì)胞標(biāo)本中yap蛋白的表達(dá)情況,初步了解yap與cml的關(guān)系;檢測(cè)bcr/abl-細(xì)胞株(hl60、thp1、nb4)、bcr/abl+細(xì)胞株(k562、kcl22、k562/g01)、p210bcr/abl轉(zhuǎn)化前(baf3、32d)和轉(zhuǎn)化后細(xì)胞株(bp210、32dp210)中yap的mrna和蛋白水平,了解bcr/abl與yap的關(guān)系;用im處理cml細(xì)胞株k562和k562/g01,研究抑制bcr/abl激酶活性對(duì)yap表達(dá)、定位、蛋白穩(wěn)定性以及其下游靶基因c-myc和survivin表達(dá)的影響;分別使用bcr/abl下游通路(mek-erk和pi3k/akt信號(hào)通路)的抑制劑u0126、pd98059和ly294002處理細(xì)胞,初步探討bcr/abl調(diào)節(jié)yap的機(jī)制。2.分別采用小干擾rna和小分子抑制劑維替泊芬(verteporfin,vp)處理兩種方法,抑制k562和k562/g01細(xì)胞中yap功能的發(fā)揮,同時(shí)聯(lián)合im與vp,通過體外實(shí)驗(yàn)觀察對(duì)cml細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的影響及作用機(jī)制。分別通過mtt實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況;流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometer,fcm)分析對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的影響;瑞氏染色觀察細(xì)胞形態(tài)變化;westernblot檢測(cè)下游基因c-myc,survivin以及細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。3.構(gòu)建k562-nod/scid小鼠血液瘤模型,觀察對(duì)照組、im、vp以及im聯(lián)合vp處理組小鼠的一般情況、外周血中wbc、cd45+白血病細(xì)胞的百分率以及生存期;對(duì)出現(xiàn)明顯發(fā)病癥狀的瀕死期小鼠進(jìn)行頸椎脫臼法處死,觀察小鼠肝、脾、肺等臟器的大小并拍照,記錄各臟器重量;4%多聚甲醛固定后,石蠟包埋,切片,he染色觀察肝、脾等組織中白血病細(xì)胞的浸潤情況;瑞氏染色觀察骨髓象的變化;定量pcr檢測(cè)骨髓細(xì)胞中c-myc和survivin的mrna水平的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與結(jié)論:1.在cml患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中yap蛋白水平明顯高于正常對(duì)照組;bcr/abl+細(xì)胞株(k562、kcl22、k562/g01)中yap的蛋白表達(dá)明顯高于bcr/abl-細(xì)胞株(hl60、thp1、nb4);與baf3、32d相比,p210bcr/abl轉(zhuǎn)化細(xì)胞株bp210和32dp210中yap的蛋白表達(dá)明顯增高但是mrna水平無明顯差異;bcr/abl抑制劑im能夠下調(diào)yap的蛋白水平,但是對(duì)mrna無影響;im能夠通過泛素蛋白酶體途徑加快yap的降解并且能夠減少yap的入核,從而抑制其下游靶基因c-myc和survivin的表達(dá);mek-erk信號(hào)通路的抑制劑u0126可以降低yap的蛋白水平。2.在cml細(xì)胞株k562和k562/g01中,采用sirna技術(shù)干擾yap的表達(dá),可以抑制細(xì)胞的增殖,促進(jìn)細(xì)胞的凋亡,同時(shí)使細(xì)胞周期阻滯于g1期。并能夠明顯抑制hippo通路下游c-myc和survivin的表達(dá),下調(diào)周期相關(guān)蛋白cyclind1的表達(dá),上調(diào)p21和bax的表達(dá),同時(shí)使凋亡相關(guān)蛋白parp及caspase3的活化增多。另外,使用yap-tead的小分子抑制劑vp處理k562和k562/g01,同樣能夠抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、將細(xì)胞周期阻滯于G1期,并且VP與IM聯(lián)合應(yīng)用能夠增強(qiáng)IM的作用。3.在K562-NOD/SCID小鼠模型中,與對(duì)照組相比,IM和VP單獨(dú)處理組及聯(lián)合處理組小鼠的發(fā)病時(shí)間及生存期明顯延長,體重減輕和外周血白細(xì)胞增高的速度減慢,肝脾腫大及白血病細(xì)胞浸潤情況有明顯改善,并且聯(lián)合處理組作用最為明顯,骨髓細(xì)胞中c-myc和survivin的mRNA水平有所降低。綜上所述,本課題發(fā)現(xiàn)YAP蛋白在CML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)高于正常對(duì)照組;BCR/ABL+細(xì)胞株中YAP的蛋白表達(dá)明顯高于BCR/ABL-細(xì)胞株;BCR/ABL通過影響YAP的蛋白穩(wěn)定性及細(xì)胞定位參與了對(duì)YAP蛋白水平的調(diào)節(jié),其下游的MEK-ERK信號(hào)通路可能參與了該過程;體外抑制YAP能夠通過下調(diào)c-Myc、survivin和cyclinD1,上調(diào)p21、Bax、cleaved-caspase3及cleaved-PARP的水平,抑制CML細(xì)胞的增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡;YAP抑制劑VP能明顯延長K562-NOD/SCID模型小鼠的發(fā)病時(shí)間及生存期。本課題的意義在于:首次在CML中研究了YAP蛋白的表達(dá)并初步探討了BCR/ABL對(duì)YAP的調(diào)節(jié)機(jī)制,通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究YAP對(duì)CML細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)的影響及相關(guān)機(jī)制,為CML的治療提供了一個(gè)新的靶點(diǎn),同時(shí)也為臨床聯(lián)合用藥奠定了一定的理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R733.72

【參考文獻(xiàn)】

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1 齊靜,彭暉,顧振綸,梁中琴,楊純正;伊馬替尼耐藥的K562細(xì)胞系的建立及其生物學(xué)特性研究[J];中華血液學(xué)雜志;2004年06期

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本文編號(hào)：1711048