本文選題：抵抗素　切入點(diǎn)：細(xì)胞凋亡　出處：《吉林大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：目的:已有文獻(xiàn)報(bào)道肥胖是乳腺癌的高危因素并與乳腺癌患者較差的治療療效和預(yù)后相關(guān)。同時(shí)還有研究表明肥胖所引起的脂肪因子分泌異常與乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)。抵抗素是一種新發(fā)現(xiàn)的脂肪因子,其在乳腺癌患者血清中分泌增多并能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、入侵和遷移。本實(shí)驗(yàn)的目的在于檢測(cè)抵抗素是否會(huì)影響阿霉素(Doxorubicn,Dox)的治療療效,其是乳腺癌化學(xué)治療中效果最好的蒽環(huán)類藥物之一,并深入探討抵抗素的作用機(jī)制。方法:1.應(yīng)用Annexin V/PI雙染色法檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231經(jīng)過(guò)阿霉素和/或抵抗素處理后細(xì)胞凋亡率;并收集細(xì)胞提取蛋白進(jìn)行Western Blot,檢測(cè)各處理組細(xì)胞細(xì)胞色素c(cytochrome c)、裂解的半胱天冬酶9(cleaved caspase-9)和裂解的聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(cleaced poly-ADP-ribose polymerase,cleaved PARP)蛋白表達(dá)水平,進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)胞凋亡水平。2.乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231經(jīng)抵抗素處理后,應(yīng)用免疫熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞LC3的表達(dá)變化,從而反映細(xì)胞自噬水平的變化。應(yīng)用Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白(如BECN1,SQSTM1,LC3B-I/II,LAMP1)的表達(dá)水平,并定量檢測(cè)LC3B-II/LC3B-I比例,進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)胞自噬水平的變化。3.應(yīng)用細(xì)胞自噬特異性抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)抑制細(xì)胞自噬后,乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231經(jīng)阿霉素和/或抵抗素處理后,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率,并用Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞Cytochrome c、cleaved Caspase-9和cleaved PARP蛋白表達(dá)水平。進(jìn)一步應(yīng)用sh RNA特異性敲除細(xì)胞自噬相關(guān)基因5(Atg5)后,應(yīng)用Annexin V/PI雙染色法檢測(cè)的細(xì)胞凋亡水平的變化。4.乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231經(jīng)抵抗素處理后,應(yīng)用Western Blot法檢測(cè)AMP激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)/雷帕霉素靶蛋白(m TOR)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。細(xì)胞用AMPK抑制劑compound C和JNK抑制劑SP600125處理后,應(yīng)用Western Blot法檢測(cè)LC3B-I/LC3B-II表達(dá)變化,同時(shí)應(yīng)用Annexin V/PI雙染色法細(xì)胞凋亡水平的變化。結(jié)果:首先我們證明了阿霉素可以有效地誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231的細(xì)胞凋亡。并且抵抗素可以明顯地以劑量依賴方式和時(shí)間依賴方式降低阿霉素所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Western Blot結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了抵抗素能下調(diào)阿霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá),如cytochrome c、cleaved caspase-9和cleaved PARP。其次免疫熒光染色結(jié)果表明抵抗素顯著地增加了MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的LC3表達(dá)量,同時(shí)Western Blot結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了抵抗素能增加細(xì)胞內(nèi)LC3B-Ⅱ,BECN1,LAMP1的蛋白表達(dá)量和LC3B-Ⅱ/LC3B-I的表達(dá)比例,而降低SQSTM1的蛋白表達(dá)量。這些結(jié)果均證明抵抗素能激活乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞自噬。為了進(jìn)一步證明抵抗素是通過(guò)細(xì)胞自噬抑制阿霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,我們用3-MA和基因敲除Atg5兩種方法抑制細(xì)胞自噬,流式細(xì)胞術(shù)以及Western Blot的結(jié)果均表明抑制細(xì)胞自噬后,抵抗素不再對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡起到保護(hù)作用。最后,Western Blot的結(jié)果顯示抵抗素能以劑量依賴的方式增加p-AMPK的蛋白表達(dá),同時(shí)降低p-m TOR和p-ULK1 Ser757的蛋白表達(dá)。并且,抵抗素可以以劑量依賴的方式使p-JNK和p-Bcl-2的蛋白表達(dá)增加。這些結(jié)果證明抵抗素能激活乳腺癌細(xì)胞中AMPK/m TOR/ULK1和JNK信號(hào)通路。抑制劑Compound C和SP600125可以分別有效地抑制這兩條信號(hào)通路的活化,并且兩者聯(lián)合應(yīng)用能拮抗抵抗素誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬和抑制細(xì)胞凋亡的作用。結(jié)論:(1)抵抗素可以對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的人類乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231的凋亡起到保護(hù)作用;(2)抵抗素可以激活人類乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231的細(xì)胞自噬效應(yīng);(3)抵抗素活化的細(xì)胞自噬可以抑制阿霉素誘導(dǎo)的人類乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231的凋亡;(4)抵抗素通過(guò)AMPK/m TOR/ULK1和JNK信號(hào)通路激活抗凋亡細(xì)胞自噬效應(yīng)。我們的實(shí)驗(yàn)首次提出了脂肪因子抵抗素可以通過(guò)誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞自噬拮抗阿霉素所引起的細(xì)胞凋亡。這些發(fā)現(xiàn)提示了在乳腺癌患者中抵抗素水平的升高可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞耐藥發(fā)生。我們的研究揭示了抵抗素在乳腺癌中新的作用,同時(shí)也為克服乳腺癌治療中的藥物抵抗提供了可能的作用靶點(diǎn)。
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本文編號(hào)：1703578