本文選題：長鏈非編碼RNA　切入點：兒童　出處：《蘇州大學》2016年博士論文

【摘要】：目的:長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,lnc RNA)在基因調控中起重要作用,目前它對兒童急性白血病(Acute leukemia,AL)發(fā)病機制的影響尚不清楚。本研究采用微矩陣基因芯片技術,研究lnc RNA在AL患兒和正常兒童表達譜的差異;篩選一個差異最大的lnc RNA:AC002454.1,通過基因沉默技術對其進行功能的初步研究,為探索lnc RNA參與兒童AL發(fā)病的分子機制提供新的思路及實驗基礎。方法:1.對初治AL患兒9例,其中急性淋巴細胞性白血病(Acute lymphocytic leukemia,ALL)6例,急性髓細胞性白血病(Acute myelocyticleukemia,AML)3例;正常健康兒童9例。分為6個樣本,AL患兒:L1(AML 3例)、L2(T-ALL 3例)、L3(B-ALL3例),正常對照:C1、C2、C3(各3例)。分別取骨髓/外周血單個核細胞,提取總RNA后進行質量測定。合格后雜交合成c DNA,經過Microarray基因芯片掃描儀掃描后得到原始數據,原始數據經過統(tǒng)計軟件轉換后進行統(tǒng)計分析,得到AL患兒與正常對照組之間lnc RNA和m RNA的差異表達譜。2.選取兒童AL中表達譜差異大于10倍以上的lnc RNA 97個,對21例ALL患兒、22例AML患兒及21例正常對照兒童,取骨髓單個核細胞,提取總RNA,并進行引物特異性逆轉錄成c DNA。采用實時熒光定量PCR(Real-time quantitative polymerase chain reaction,q RT-PCR)技術,GAPDH做內參,循環(huán)閾值(Ct值)比較法進行l(wèi)nc RNA表達定量分析,并與芯片結果驗證。選其中差異最大的lnc RNA:AC002454.1分析其表達量與臨床指標的關系。3.綜合NCBI Ref Seq、UCSC、RNAdb、Lnc RNAs等數據庫資源,對芯片結果進行Gene Ontology、Pathways等生物信息學分析,并通過計算Pearson相關系數建立lnc RNA與靶基因的基因網絡圖。4.選用白血病細胞株K562,NB4作為研究對象,構建并轉染慢病毒載體下調AC002454.1表達,分別采用CCK8法、流式細胞儀技術、Western-blot等實驗觀察其對白血病細胞株增殖、凋亡、周期等生物學行為的影響以及CDK6表達的變化。結果:1.兒童AL差異表達的lnc RNA 2409個,其中上調2倍以上1394個,下調2倍以上1015個;差異表達的m RNA 2331個,其中上調2倍以上1073個,下調2倍以上1258個。兒童ALL差異表達的lnc RNA 1884個,其中上調2倍以上的1106個,下調2倍以上的778個;差異表達的m RNA 1857個,其中上調2倍以上905個,下調2倍以上952個。兒童AML差異表達的lnc RNA 4289個,其中上調2倍以上的2215個,下調2倍以上的2074個;差異表達的m RNA 4003個,其中上調2倍以上1769個,下調2倍以上2234個。2.q RT-PCR驗證兒童AL差異大于10倍以上lnc RNA:ALL組顯著上調9個(uc002ehu.1、AC002454.1、uc001guz.2、BC035649、uc001kpt.2、AK123765、NR_026776、NR_027182、ENST00000508489),顯著下調7個(ENST00000415964、uc010arh.1、ENST00000457799、ENST00000511213、NR_002712、X61079、ENST00000417930);AML組中顯著上調12個(AC002454.1、uc002ehu.1、ENST00000509150、uc001guz.2、ENST00000457457、uc001kpt.2、NR_027182、AK123765、BC031319、AK124936、uc003hhv.1、NR_026776),顯著下調12個(AK027193、AK024584、BC005232、AK094982、uc003ebe.1、ENST00000512129、AF088004、uc002vje.1、uc010arh.1、ENST00000428188、ENST00000457799、ENST00000415964),結果與芯片一致。AC002454.1相對表達量與AL患兒性別、年齡、初診時WBC計數、染色體、融合基因、危險度分層、預后等各項臨床指標,無顯著性差異(P值均0.05)。初診AL患兒不同免疫分型的AC002454.1相對表達量差異顯著(P0.05)。3.GO分析顯示,上調的m RNA:413個參與生物學進程(Biological process)、90個參與細胞組件(Cellular component)、94個參與分子功能(Molecular function),分別以細胞周期(Cell cycle phase)、細胞內(Intracellular part)和催化活性(Catalytic activity)富集程度最高;下調m RNA:665個參與生物學進程、59個參與細胞組件、118個參與分子功能,分別以免疫反應(Immune response),質膜(Plasma membrane)和蛋白結合(Protein binding)富集程度最高。4.Pathway分析顯示,24條基因通路受上調的m RNA調控,富集程度最高的是通路是細胞周期(Cell cycle),由26個目的基因組成;32條基因通路受下調的m RNA調控,富集程度最高的是通路是造血細胞系(Hematopoietic cell lineage),由23個目的基因組成。5.對表達差異顯著的10個lnc RNA基因:ENST00000435695(AC002454.1)、ENST00000509150、NR_027182、AK124936、uc003hhv.1、AK027193、BC005232、ENST00000428188、ENST00000415964、NR_002712,通過計算與目的基因的Pearson相關系數(≥0.95),得到797個目的基因,并共同建立編碼-非編碼基因共表達網絡(Coding-noncoding gene co-expression network)。6.下調AC002454.1表達可以抑制白血病細胞株K562和NB4的增殖(P0.05)、提高細胞凋亡率和延長NB4細胞細胞G2/M期。下調AC002454.1表達后K562細胞和NB4細胞的CDK6表達水平低于對照組。結論:1.本研究首次采用lnc RNA microarray基因芯片揭示兒童AL異常的lnc RNA表達譜,并對明顯表達異常的lnc RNA采用q RT-PCR進行驗證,結果與芯片一致。顯示lnc RNA microarray基因芯片檢測是一種理想高效的方法2.AL患兒lnc RNA表達與正常兒童存在明顯差異,發(fā)現并確定了一個新的基因:AC002454.1在AL各型患兒中異常高表達,且表達量與AL患兒的免疫分型相關,可望成為兒童AL分型和判斷預后的分子標記物。3.生物信息提示異常表達的lnc RNA、m RNA參與整個白血病細胞的多個生命過程及通路,調節(jié)細胞的轉化和惡變,網絡調控機制復雜。其本身以及它們參與調控的通路均有可能成為兒童AL基因干預治療的新靶點。4.體外功能試驗提示:下調AC002454.1表達可抑制白血病細胞的增殖能力、影響細胞周期和提高凋亡率;下調AC002454.1表達可影響CDK6表達,為進一步明確AC002454.1生物學功能、探索lnc RNA參與兒童AL發(fā)病的分子機制提供了新的思路和實驗基礎。
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【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R733.71
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本文編號：1703501