本文選題：膠質母細胞瘤　切入點：miR-16　出處：《安徽醫(yī)科大學》2017年碩士論文

【摘要】：背景和目的:膠質母細胞瘤是腦腫瘤中最常見的致死性腫瘤,是一種多基因異常疾病,涉及大量信號通路的調控和多個基因的表達異常[1-3],其中也包括mi RNAs對基因表達的精準調控[4-5],但詳細機制不十分清楚。盡管采取綜合性治療及靶向治療,其患者中位生存期仍不足15個月。腫瘤干細胞理論認為腫瘤干細胞是惡性腫瘤復發(fā)的根源。因而研究膠質母細胞瘤細胞及干細胞生長和侵襲的分子機制具有重要的臨床價值,可以促進更有效的治療手段或藥物的研發(fā),有望提高患者的生存期。micro RNAs(mi RNAs)是一類由內源性基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子,按其功能可分原癌基因功能的mi RNAs、抑癌基因功能的mi RNAs和調控干細胞功能的mi RNAs,他們在腫瘤發(fā)生或發(fā)展中通過多種分子機制參與經(jīng)典的遺傳學和表觀遺傳學調控[6-7]。膠質瘤相關mi RNAs研究中,具有原癌基因功能的有mi R-21、mi R-221/222、mi R-10b、mi R-17-92基因簇等[8-10],具有抑癌基因功能的有mi R-128、mi R-34a、mi R-7、mi R124/mi R-137d[11-12]等。mi R-16首次發(fā)現(xiàn)在慢性淋巴細胞白血病中低表達,可能具有抑癌基因的功能[13]。迄今已發(fā)現(xiàn)多種調節(jié)膠質瘤干細胞(Glioblastoma stem cells,GSCs)和神經(jīng)干細胞的stem-mi Rs,參與調控BMPs(形態(tài)形成蛋白)、SHH(Sonic hedgehog通路)和NOTCH等多條信號通路,其中調控GSCs增殖和分化的有mi R-124、mi R-135b和mi R-37等[14-15];調控自我更新的有mi R-7、mi R-9、mi R-34a、mi R-124、mi R-128、mi R-326和mi R-451等[16];調控化療耐藥和放療抵抗的有mi R-181b[17]等。本課題組前期實驗研究結果證實在膠質瘤組織和細胞系中mi R-16均顯著低表達,可能與膠質瘤的發(fā)生相關。通過對micro RNA.org、Targetscan和mi R Walk數(shù)據(jù)庫的分析,預測Wip1可能是mi R-16的靶基因之一。Wip1(wild-type p53-induced phosphatase 1,野生型p53誘導的磷酸酶1基因)是近年發(fā)現(xiàn)的一種原癌基因,研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中高表達,與腫瘤的增殖和預后相關,可以通過作用于其下游靶基因p53以及Wip1-p53通路參與細胞周期和細胞凋亡過程,且與腫瘤的放療抵抗、化療耐藥及預后不良相關[18-19]。有研究顯示p53與膠質瘤及其腫瘤干細胞關系密切[20-21],但其調控機制尚未明確。基于此,本研究試圖通過上調膠質母細胞瘤細胞U87和U251及其干細胞中的mi R-16,以探討mi R-16對膠質母細胞瘤增殖和侵襲等生物學功能的影響,以及mi R-16調控Wip1-p53通路的機制,進一步深入解析mi R-16及其靶基因在膠質母細胞瘤中的抑癌作用。方法:膠質母細胞瘤U87和U251及其干細胞(GSC-U87和GSC-U251)的培養(yǎng);干細胞分化實驗及免疫熒光染色方法鑒定干細胞;Lipfectamine2000脂質體法將化學合成的mi R-16寡核苷酸隨機序列(mi R-16 mimics和mi R-16 mimics negative control)轉染到人腦膠質母細胞瘤細胞株U87和U251及其干細胞中,構建mi R-16過表達的膠質母細胞瘤細胞和干細胞模型;q RT-PCR技術檢測轉染細胞中后mi R-16、Wip1和p53 m RNA表達情況;平板克隆和Ed U實驗檢測mi R-16對細胞的生長、增殖影響,流式細胞儀檢測mi R-16對細胞的凋亡和周期的影響;Transwell侵襲和劃痕實驗檢測mi R-16對細胞遷移、侵襲能力的影響;雙熒光素酶報告基因實驗驗證mi R-16與Wip1 3’-UTR的關系;Western blot技術檢測mi R-16的預測靶基因Wip1及其下游基因p53的蛋白表達水平。結果:膠質瘤細胞干細胞培養(yǎng),分化后的細胞表達GFAP,CD133和Nestin失表達,而GSC-U87和GSC-U251細胞表達CD133和Nestin,GFAP失表達,表明本實驗培養(yǎng)的GSC-U87和GSC-U251細胞為膠質瘤干細胞;轉染mi R-16 mimics后mi R-16的表達顯著升高,Wip1 m RNA及蛋白表達降低,p53 m RNA及蛋白表達升高;過表達mi R-16使U87和U251細胞及其干細胞生長增殖和侵襲能力下降,G1期細胞增多,S期細胞減少,細胞早期凋亡率增加。結論:mi R-16抑制U87和U251細胞及其干細胞的增殖和侵襲能力,促進凋亡發(fā)生;mi R-16通過抑制其靶基因Wip1的表達而使p53高表達,從而在膠質母細胞瘤中發(fā)揮抑癌作用。
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【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R739.41

【參考文獻】

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本文編號：1703721