本文選題：孕激素受體M　切入點：原代培養(yǎng)　出處：《鄭州大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：孕激素受體M(mitochondrial progesterone receptor,PR-M)是一種新型的孕激素受體,在2002年由Saner,KJ等發(fā)現(xiàn),其定位于核外線粒體,與傳統(tǒng)孕激素受體PR-A、PR-B相比結(jié)構(gòu)上缺乏N端的A/B結(jié)構(gòu)區(qū)和DNA結(jié)合區(qū),僅有鉸鏈區(qū)和配體結(jié)合區(qū),是截短的新型孕激素受體。PR-M獨特的線粒體定位功能可能是由于其氨基末端的16個氨基酸所組成序列中包含的線粒體定位序列(mitochondrial localization signal,MLS)的存在。目前認(rèn)為,PR-M可能通過調(diào)節(jié)線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,MMP)發(fā)揮其獨特的作用。研究發(fā)現(xiàn)孕激素可以通過劑量依賴性增加原代培養(yǎng)的子宮平滑肌細(xì)胞和永生化子宮平滑肌細(xì)胞的線粒體膜電位的形式發(fā)揮作用,并且這種反應(yīng)的發(fā)生可以被孕激素受體拮抗劑抑制。從而說明孕激素可能通過PR-M的非基因組作用增加細(xì)胞的能量代謝,而細(xì)胞內(nèi)能量的增加使得細(xì)胞發(fā)生異常增殖。孕激素可以促使PR-M使線粒體膜電位增加,抑制乳腺癌細(xì)胞、原代和永生化子宮平滑肌細(xì)胞的凋亡。子宮肌瘤(leiomyoma)是最常見的女性盆腔良性腫瘤,影響30%-50%的育齡期女性,且發(fā)病率呈逐年上升趨勢,是臨床子宮切除術(shù)的主要原因,臨床表現(xiàn)有月經(jīng)異常,不孕,和疼痛等,嚴(yán)重影響女性患者的生存質(zhì)量。然而至今其病因病機仍未明確,探討其發(fā)病機制及有效的治療方案一直是國內(nèi)外婦科方面專家研究的熱點。文獻(xiàn)報道基礎(chǔ)和臨床研究均已表明孕激素在子宮平滑肌瘤的發(fā)生中發(fā)揮著重要的作用。我們先前的研究發(fā)現(xiàn)肌瘤組織中孕激素受體PR-B、PR-A和PR-M的表達(dá)均明顯高于它們在子宮肌瘤旁正常子宮平滑肌組織中的表達(dá)水平,提示PR-M在肌瘤生長過程中可能發(fā)揮促進(jìn)作用,孕激素在肌瘤組織中可能通過基因組和非基因組途徑發(fā)揮雙重效應(yīng)。米非司酮(Mifepristone,RU 486)是一種結(jié)構(gòu)類似類固醇激素的復(fù)合物。這種復(fù)合物對于孕激素受體和糖皮質(zhì)激素受體具有極強的親和力,并在較小程度上與雄激素受體結(jié)合。它通過不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,發(fā)揮基因組和非基因組作用。米非司酮最初作為妊娠早期的流產(chǎn)藥物應(yīng)用,近年來也應(yīng)用于治療子宮肌瘤等疾病,米非司酮用于治療子宮肌瘤具有效果好,副作用少,復(fù)發(fā)率低等優(yōu)勢,但作用機制目前尚不明確。目的在課題組之前的研究基礎(chǔ)上收集肌瘤標(biāo)本提取原代子宮肌瘤細(xì)胞作為研究材料,Western blot檢測孕激素受體的表達(dá)并篩選出PR-M陽性細(xì)胞株,應(yīng)用不同濃度梯度的孕激素受體抑制劑RU486干預(yù)后,分別應(yīng)用CCK-8法和流式細(xì)胞儀檢測PR-M陽性組和PR-M陰性組子宮肌瘤細(xì)胞增殖和凋亡的變化情況,進(jìn)一步研究PR-M在子宮肌瘤發(fā)生發(fā)展中的作用,探討其可能的作用機制,從而深化對PR-M功能作用的理解,給婦產(chǎn)科孕激素相關(guān)疾病的診斷治療提供新的思路和研究方向。材料和方法1研究對象隨機選取2015年9月到2016年6月期間在我院(即鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院)因單純子宮肌瘤行腹腔鏡下全子宮切除術(shù)或腹式肌瘤挖除術(shù)的患者11例,年齡24~48歲,平均(42±4.49)歲。所有患者均不伴隨其他性激素相關(guān)合并癥,且手術(shù)治療前至少半年內(nèi)無類固醇激素應(yīng)用史。收集的標(biāo)本均同時經(jīng)過腹腔鏡或開腹手術(shù)診斷、術(shù)后常規(guī)病理檢查證實。所有標(biāo)本的收集均經(jīng)過患者的知情同意并簽署知情同意書,并經(jīng)本院倫理委員會審核通過。術(shù)中在無菌操作下取大小1-3cm3的肌瘤組織塊數(shù)塊,置于冰盒內(nèi)保存且含雙抗(青鏈霉素混合液)的DMEM-F12(FD)培養(yǎng)液中,盡快運回實驗室進(jìn)行下一步處理。2試驗方法(1)分離子宮肌瘤組織,提取、培養(yǎng)原代子宮平滑肌瘤細(xì)胞,并經(jīng)倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),免疫細(xì)胞化學(xué)法(α-SMA單克隆抗體)鑒定確認(rèn)為子宮平滑肌瘤細(xì)胞;(2)應(yīng)用免疫印跡法(Western Blotting)檢測孕激素受體PR-M、PR-A和PR-B的表達(dá)并篩選出PR-M陽性細(xì)胞株(即僅表達(dá)PR-M,不表達(dá)PR-A/B的細(xì)胞株)作為研究組,PR-M陰性細(xì)胞株(即不表達(dá)PR-M,僅表達(dá)PR-A/B的細(xì)胞株)作為對照組,T-47D乳腺癌細(xì)胞株(購自American Type Culture Collection)作為篩選細(xì)胞的陽性對照(T47D是經(jīng)文獻(xiàn)證實的同時表達(dá)PR-A/B和PR-M的細(xì)胞株,因現(xiàn)階段缺乏針對PR-M的特異性抗體,故選擇陽性細(xì)胞株用以確認(rèn)篩選結(jié)果)(3)不同濃度RU-486(空白對照,1×10~(-6)umol/ml,1×10~(-5)umol/ml,1×10~(-4)umol/ml)干預(yù)兩組細(xì)胞后,利用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖情況并計算細(xì)胞增殖抑制率(加入CCK-8試劑后對各組細(xì)胞在波長450nm處的吸光度(A)值進(jìn)行檢測,每組重復(fù)三次,設(shè)置四個復(fù)孔。增殖抑制率的計算公式為對照組和實驗組差值與對照組和空白對照組差值的比值。(4)不同濃度RU-486(空白對照,1×10~(-6)mol/L,1×10~(-5)mol/L,1×10~(-4)mol/L)干預(yù)兩組細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況并計算細(xì)胞凋亡率。結(jié)果1.培養(yǎng)子宮肌瘤細(xì)胞11例成功10例,其中1例因細(xì)胞量偏少,棄之;成功率91%,與文獻(xiàn)報道接近。子宮肌瘤細(xì)胞的鑒定:大部分細(xì)胞于接種后24h內(nèi)貼壁并逐漸伸展呈基本規(guī)則的長梭形并緩慢生長,3天左右細(xì)胞生長速度加快,一周左右進(jìn)入對數(shù)期,且密集處多呈旋渦狀,鏡下見典型的“峰-谷”樣現(xiàn)象,應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定為子宮肌瘤細(xì)胞(見圖1)。2.Western blot檢測孕激素受體PR-A/B,PR-M在子宮肌瘤細(xì)胞中的表達(dá)后成功篩選出表達(dá)PR-M而不表達(dá)PR-A/B的標(biāo)本作為研究組,且篩選表達(dá)PR-A/B不表達(dá)PR-M的標(biāo)本作為陰性對照組。3.RU-486干預(yù)后兩組肌瘤細(xì)胞增殖的變化:倒置顯微鏡下觀察可以看到,RU-486作用48h后細(xì)胞開始變形,且隨著RU-486濃度的不斷增加,兩組細(xì)胞的增殖抑制率不斷增加,PR-M陽性組與空白對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=8.27,P均0.05);PR-M陰性組與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=9.14,P均0.05)。增殖抑制率增加呈現(xiàn)出劑量依賴性(P0.05)。PR-M陽性組的增殖抑制率小于PR-M陰性組,相同濃度作用組間兩兩比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均0.05)。4.RU-486干預(yù)后兩組肌瘤細(xì)胞凋亡率的變化:PR-M陽性組與空白對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=7.44,P均0.05);PR-M陰性組與空白對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=8.32,P均0.05)。隨著藥物濃度的不斷增加,細(xì)胞凋亡率均逐漸增加(P0.05)。相同濃度作用組間兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均0.05)。結(jié)論1.PR-M在子宮肌瘤的發(fā)生發(fā)展中可能通過抑制子宮肌瘤細(xì)胞凋亡,促進(jìn)肌瘤細(xì)胞增殖發(fā)揮重要作用。2.PR-M的作用可能被孕激素受體抑制劑所抑制。
[Abstract]:PR - M is one of the most common female pelvic benign tumors , which affects the survival quality of female patients . The mechanism of PR - M positive control ( PR - M , PR - A / B only ) was examined by Western Blotting . The expression of PR - A / B , PR - M , PR - M , PR - M , PR - M , PR - M , PR - M , PR - M , PR - M , PR - M , PR - M , PR - M , PR - M and PR - M were observed . The proliferation inhibition rate of PR - M positive group was less than that of PR - M negative group , and the difference was statistically significant ( F = 7.44 , P < 0.05 ) . The difference of PR - M negative group and blank control group was significant ( F = 8.32 , P < 0.05 ) . Conclusion 1 . PR - M may play an important role in the development of uterine fibroids . Conclusion 1 . PR - M may play an important role in the development of uterine fibroids .

【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R737.33

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本文編號：1701059