本文選題：孕激素受體M　切入點(diǎn)：原代培養(yǎng)　出處：《鄭州大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：孕激素受體M(mitochondrial progesterone receptor,PR-M)是一種新型的孕激素受體,在2002年由Saner,KJ等發(fā)現(xiàn),其定位于核外線(xiàn)粒體,與傳統(tǒng)孕激素受體PR-A、PR-B相比結(jié)構(gòu)上缺乏N端的A/B結(jié)構(gòu)區(qū)和DNA結(jié)合區(qū),僅有鉸鏈區(qū)和配體結(jié)合區(qū),是截短的新型孕激素受體。PR-M獨(dú)特的線(xiàn)粒體定位功能可能是由于其氨基末端的16個(gè)氨基酸所組成序列中包含的線(xiàn)粒體定位序列(mitochondrial localization signal,MLS)的存在。目前認(rèn)為,PR-M可能通過(guò)調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,MMP)發(fā)揮其獨(dú)特的作用。研究發(fā)現(xiàn)孕激素可以通過(guò)劑量依賴(lài)性增加原代培養(yǎng)的子宮平滑肌細(xì)胞和永生化子宮平滑肌細(xì)胞的線(xiàn)粒體膜電位的形式發(fā)揮作用,并且這種反應(yīng)的發(fā)生可以被孕激素受體拮抗劑抑制。從而說(shuō)明孕激素可能通過(guò)PR-M的非基因組作用增加細(xì)胞的能量代謝,而細(xì)胞內(nèi)能量的增加使得細(xì)胞發(fā)生異常增殖。孕激素可以促使PR-M使線(xiàn)粒體膜電位增加,抑制乳腺癌細(xì)胞、原代和永生化子宮平滑肌細(xì)胞的凋亡。子宮肌瘤(leiomyoma)是最常見(jiàn)的女性盆腔良性腫瘤,影響30%-50%的育齡期女性,且發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì),是臨床子宮切除術(shù)的主要原因,臨床表現(xiàn)有月經(jīng)異常,不孕,和疼痛等,嚴(yán)重影響女性患者的生存質(zhì)量。然而至今其病因病機(jī)仍未明確,探討其發(fā)病機(jī)制及有效的治療方案一直是國(guó)內(nèi)外婦科方面專(zhuān)家研究的熱點(diǎn)。文獻(xiàn)報(bào)道基礎(chǔ)和臨床研究均已表明孕激素在子宮平滑肌瘤的發(fā)生中發(fā)揮著重要的作用。我們先前的研究發(fā)現(xiàn)肌瘤組織中孕激素受體PR-B、PR-A和PR-M的表達(dá)均明顯高于它們?cè)谧訉m肌瘤旁正常子宮平滑肌組織中的表達(dá)水平,提示PR-M在肌瘤生長(zhǎng)過(guò)程中可能發(fā)揮促進(jìn)作用,孕激素在肌瘤組織中可能通過(guò)基因組和非基因組途徑發(fā)揮雙重效應(yīng)。米非司酮(Mifepristone,RU 486)是一種結(jié)構(gòu)類(lèi)似類(lèi)固醇激素的復(fù)合物。這種復(fù)合物對(duì)于孕激素受體和糖皮質(zhì)激素受體具有極強(qiáng)的親和力,并在較小程度上與雄激素受體結(jié)合。它通過(guò)不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,發(fā)揮基因組和非基因組作用。米非司酮最初作為妊娠早期的流產(chǎn)藥物應(yīng)用,近年來(lái)也應(yīng)用于治療子宮肌瘤等疾病,米非司酮用于治療子宮肌瘤具有效果好,副作用少,復(fù)發(fā)率低等優(yōu)勢(shì),但作用機(jī)制目前尚不明確。目的在課題組之前的研究基礎(chǔ)上收集肌瘤標(biāo)本提取原代子宮肌瘤細(xì)胞作為研究材料,Western blot檢測(cè)孕激素受體的表達(dá)并篩選出PR-M陽(yáng)性細(xì)胞株,應(yīng)用不同濃度梯度的孕激素受體抑制劑RU486干預(yù)后,分別應(yīng)用CCK-8法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)PR-M陽(yáng)性組和PR-M陰性組子宮肌瘤細(xì)胞增殖和凋亡的變化情況,進(jìn)一步研究PR-M在子宮肌瘤發(fā)生發(fā)展中的作用,探討其可能的作用機(jī)制,從而深化對(duì)PR-M功能作用的理解,給婦產(chǎn)科孕激素相關(guān)疾病的診斷治療提供新的思路和研究方向。材料和方法1研究對(duì)象隨機(jī)選取2015年9月到2016年6月期間在我院(即鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院)因單純子宮肌瘤行腹腔鏡下全子宮切除術(shù)或腹式肌瘤挖除術(shù)的患者11例,年齡24~48歲,平均(42±4.49)歲。所有患者均不伴隨其他性激素相關(guān)合并癥,且手術(shù)治療前至少半年內(nèi)無(wú)類(lèi)固醇激素應(yīng)用史。收集的標(biāo)本均同時(shí)經(jīng)過(guò)腹腔鏡或開(kāi)腹手術(shù)診斷、術(shù)后常規(guī)病理檢查證實(shí)。所有標(biāo)本的收集均經(jīng)過(guò)患者的知情同意并簽署知情同意書(shū),并經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核通過(guò)。術(shù)中在無(wú)菌操作下取大小1-3cm3的肌瘤組織塊數(shù)塊,置于冰盒內(nèi)保存且含雙抗(青鏈霉素混合液)的DMEM-F12(FD)培養(yǎng)液中,盡快運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行下一步處理。2試驗(yàn)方法(1)分離子宮肌瘤組織,提取、培養(yǎng)原代子宮平滑肌瘤細(xì)胞,并經(jīng)倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),免疫細(xì)胞化學(xué)法(α-SMA單克隆抗體)鑒定確認(rèn)為子宮平滑肌瘤細(xì)胞;(2)應(yīng)用免疫印跡法(Western Blotting)檢測(cè)孕激素受體PR-M、PR-A和PR-B的表達(dá)并篩選出PR-M陽(yáng)性細(xì)胞株(即僅表達(dá)PR-M,不表達(dá)PR-A/B的細(xì)胞株)作為研究組,PR-M陰性細(xì)胞株(即不表達(dá)PR-M,僅表達(dá)PR-A/B的細(xì)胞株)作為對(duì)照組,T-47D乳腺癌細(xì)胞株(購(gòu)自American Type Culture Collection)作為篩選細(xì)胞的陽(yáng)性對(duì)照(T47D是經(jīng)文獻(xiàn)證實(shí)的同時(shí)表達(dá)PR-A/B和PR-M的細(xì)胞株,因現(xiàn)階段缺乏針對(duì)PR-M的特異性抗體,故選擇陽(yáng)性細(xì)胞株用以確認(rèn)篩選結(jié)果)(3)不同濃度RU-486(空白對(duì)照,1×10~(-6)umol/ml,1×10~(-5)umol/ml,1×10~(-4)umol/ml)干預(yù)兩組細(xì)胞后,利用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(加入CCK-8試劑后對(duì)各組細(xì)胞在波長(zhǎng)450nm處的吸光度(A)值進(jìn)行檢測(cè),每組重復(fù)三次,設(shè)置四個(gè)復(fù)孔。增殖抑制率的計(jì)算公式為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組差值與對(duì)照組和空白對(duì)照組差值的比值。(4)不同濃度RU-486(空白對(duì)照,1×10~(-6)mol/L,1×10~(-5)mol/L,1×10~(-4)mol/L)干預(yù)兩組細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況并計(jì)算細(xì)胞凋亡率。結(jié)果1.培養(yǎng)子宮肌瘤細(xì)胞11例成功10例,其中1例因細(xì)胞量偏少,棄之;成功率91%,與文獻(xiàn)報(bào)道接近。子宮肌瘤細(xì)胞的鑒定:大部分細(xì)胞于接種后24h內(nèi)貼壁并逐漸伸展呈基本規(guī)則的長(zhǎng)梭形并緩慢生長(zhǎng),3天左右細(xì)胞生長(zhǎng)速度加快,一周左右進(jìn)入對(duì)數(shù)期,且密集處多呈旋渦狀,鏡下見(jiàn)典型的“峰-谷”樣現(xiàn)象,應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定為子宮肌瘤細(xì)胞(見(jiàn)圖1)。2.Western blot檢測(cè)孕激素受體PR-A/B,PR-M在子宮肌瘤細(xì)胞中的表達(dá)后成功篩選出表達(dá)PR-M而不表達(dá)PR-A/B的標(biāo)本作為研究組,且篩選表達(dá)PR-A/B不表達(dá)PR-M的標(biāo)本作為陰性對(duì)照組。3.RU-486干預(yù)后兩組肌瘤細(xì)胞增殖的變化:倒置顯微鏡下觀察可以看到,RU-486作用48h后細(xì)胞開(kāi)始變形,且隨著RU-486濃度的不斷增加,兩組細(xì)胞的增殖抑制率不斷增加,PR-M陽(yáng)性組與空白對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.27,P均0.05);PR-M陰性組與空白對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.14,P均0.05)。增殖抑制率增加呈現(xiàn)出劑量依賴(lài)性(P0.05)。PR-M陽(yáng)性組的增殖抑制率小于PR-M陰性組,相同濃度作用組間兩兩比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均0.05)。4.RU-486干預(yù)后兩組肌瘤細(xì)胞凋亡率的變化:PR-M陽(yáng)性組與空白對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.44,P均0.05);PR-M陰性組與空白對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.32,P均0.05)。隨著藥物濃度的不斷增加,細(xì)胞凋亡率均逐漸增加(P0.05)。相同濃度作用組間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均0.05)。結(jié)論1.PR-M在子宮肌瘤的發(fā)生發(fā)展中可能通過(guò)抑制子宮肌瘤細(xì)胞凋亡,促進(jìn)肌瘤細(xì)胞增殖發(fā)揮重要作用。2.PR-M的作用可能被孕激素受體抑制劑所抑制。
[Abstract]:PR - M is one of the most common female pelvic benign tumors , which affects the survival quality of female patients . The mechanism of PR - M positive control ( PR - M , PR - A / B only ) was examined by Western Blotting . The expression of PR - A / B , PR - M , PR - M , PR - M , PR - M , PR - M , PR - M , PR - M , PR - M , PR - M , PR - M , PR - M , PR - M and PR - M were observed . The proliferation inhibition rate of PR - M positive group was less than that of PR - M negative group , and the difference was statistically significant ( F = 7.44 , P < 0.05 ) . The difference of PR - M negative group and blank control group was significant ( F = 8.32 , P < 0.05 ) . Conclusion 1 . PR - M may play an important role in the development of uterine fibroids . Conclusion 1 . PR - M may play an important role in the development of uterine fibroids .

【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R737.33

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本文編號(hào)：1701059