本文選題：鼻咽癌　切入點：STGC3　出處：《南華大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：[目的]本研究運用sh RNA技術(shù),敲低永生化人鼻咽黏膜上皮NP69細(xì)胞中STGC3基因的表達,構(gòu)建STGC3穩(wěn)定低表達NP69細(xì)胞,分析STGC3基因表達降低對其生長、增殖、侵襲、遷移及裸鼠成瘤能力等生物學(xué)行為的影響;應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),分析STGC3基因低表達對NP69細(xì)胞蛋白質(zhì)表達譜的影響,篩選與鑒定差異表達蛋白質(zhì)分子,實驗驗證與分析差異表達蛋白質(zhì)分子的功能,明確STGC3基因在鼻咽黏膜上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程可能發(fā)揮的作用及其分子機制,為全面揭示STGC3基因的功能提供實驗依據(jù)。[方法]根據(jù)堿基序列設(shè)計靶向干擾STGC3基因的sh RNA,構(gòu)建真核表達干擾載體,應(yīng)用脂質(zhì)體2000將重組質(zhì)粒及對照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染NP69細(xì)胞,經(jīng)不同濃度G418篩選,建立STGC3穩(wěn)定低表達的NP69細(xì)胞系,運用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)及細(xì)胞集落形成實驗,分析觀察其生長、增殖及細(xì)胞周期的變化;同時分別采用Transwell小室及裸鼠成瘤實驗,分析探究其遷移、侵襲能力及裸鼠成瘤能力的變化;再運用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選、鑒定其差異表達蛋白質(zhì)分子,分析其生物學(xué)功能;并運用IPA(Ingenuity Pathways Analysis)分析差異蛋白質(zhì)分子之間的相互作用。隨后運用RT-PCR、Western-Blotting驗證部分差異蛋白質(zhì)分子的表達,并檢測其在鼻咽癌細(xì)胞及鼻咽癌組織中的表達;在此基礎(chǔ)上進一步干預(yù)差異表達蛋白質(zhì)分子的功能,研究其對STGC3基因低表達NP69細(xì)胞系及鼻咽癌細(xì)胞生長、增殖、侵襲與遷移能力的影響,同時檢測其相關(guān)信號通路蛋白質(zhì)分子的表達。[結(jié)果]經(jīng)菌落PCR、雙酶切及測序鑒定,確定成功構(gòu)建了STGC3真核表達干擾載體并命名為p RNAi-U6.1/sh RNA/STGC3。將其與對照質(zhì)粒p RNAi-U6.1/scramble分別轉(zhuǎn)染NP69細(xì)胞并經(jīng)400μg/ml G418篩選后,熒光顯微鏡下能見到轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光,RT-PCR檢測結(jié)果顯示,p RNAi-U6.1/sh RNA/STGC3干擾載體轉(zhuǎn)染NP69細(xì)胞后,STGC3 m RNA水平顯著低于對照組,表明該干擾載體能成功敲低NP69細(xì)胞中STGC3基因的表達,穩(wěn)定低表達STGC3的NP69細(xì)胞(p RNAi-U6.1/sh RNA/STGC3/NP69細(xì)胞)建立成功。細(xì)胞生長曲線及細(xì)胞集落形成實驗結(jié)果顯示,從第4天開始,p RNAi-U6.1/sh RNA/STGC3/NP69細(xì)胞生長增殖速度明顯快于對照組;其所形成的細(xì)胞集落數(shù)目明顯多于對照組,集落體積也大于對照組(p0.05),表明STGC3基因低表達后能促進NP69細(xì)胞生長增殖,增強其克隆形成能力。FCM分析結(jié)果表明,p RNAi-U6.1/sh RNA/STGC3/NP69細(xì)胞處于(G2+S)期比例明顯高于對照組(p0.05),表明STGC3基因低表達后能影響細(xì)胞周期進程,提高細(xì)胞增殖速度及克隆形成能力。Transwell小室實驗結(jié)果顯示,未包被Matrigel時,p RNAi-U6.1/sh RNA/STGC3/NP69細(xì)胞其遷移細(xì)胞數(shù)(320.42±28.54)明顯多于p RNAi-U6.1/scramble/NP69細(xì)胞(206.26±15.40)及未轉(zhuǎn)染的NP69細(xì)胞(180.72±16.03);包被Matrigel時,p RNAi-U6.1/sh RNA/STGC3/NP69細(xì)胞其遷移細(xì)胞數(shù)(116.33±3.55)也明顯多于對照組[分別為(43.00±2.00)、(40.67±2.52)],差異均有顯著性意義(p0.05),表明STGC3基因低表達后能增強NP69細(xì)胞的遷移、侵襲能力;將p RNAi-U6.1/sh RNA/STGC3/NP69細(xì)胞及對照組細(xì)胞分別接種于裸鼠皮下,經(jīng)8周飼養(yǎng)并觀察,但均未見腫瘤的形成。i TRAQ同位素標(biāo)記及質(zhì)譜技術(shù)分析結(jié)果顯示,與對照組比較,p RNAi-U6.1/sh RNA/STGC3/NP69細(xì)胞中蛋白質(zhì)表達譜發(fā)生改變,共鑒定出表達差異明顯的蛋白質(zhì)分子83種,其中表達上調(diào)的蛋白質(zhì)有45種,包括m TOR、TPM2、Cofilin-1、ANXA3、Musashi-2、Kindlin-2等;表達下調(diào)的蛋白質(zhì)有38種,包括Beclin-1、TSC-22、AMOTL2等,這些差異蛋白主要參與調(diào)控細(xì)胞生長增殖、蛋白質(zhì)合成、物質(zhì)代謝、細(xì)胞骨架、信號傳導(dǎo)及自噬等細(xì)胞生命活動過程。IPA蛋白質(zhì)相互作用分析軟件表明,這些差異表達蛋白之間形成復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò),影響p RNAi-U6.1/sh RNA/STGC3/NP69細(xì)胞的功能。經(jīng)過RT-PCR、Western-Blotting及免疫組化等檢測發(fā)現(xiàn),與對照組比較,p RNAi-U6.1/sh RNA/STGC3/NP69細(xì)胞中m TOR表達增強、Beclin-1表達降低,證實了蛋白質(zhì)組學(xué)檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可信性;同時檢測發(fā)現(xiàn)在CNE1、CNE2鼻咽癌細(xì)胞及鼻咽癌組織中也存在m TOR表達增強、Beclin-1表達降低,且鼻咽癌組織中m TOR蛋白的表達與Beclin-1蛋白表達呈負(fù)相關(guān);臨床Ⅲ、Ⅳ期患者及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組織中m TOR蛋白陽性表達率分別高于臨床Ⅱ期患者及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者,差異具有顯著性意義(p0.05)。應(yīng)用不同濃度(0、1、2、4、8μmol/L)的雷帕霉素處理p RNAi-U6.1/sh RNA/STGC3/NP69、CNE1、CNE2細(xì)胞后,雷帕霉素能顯著抑制p RNAi-U6.1/sh RNA/STGC3/NP69、CNE2細(xì)胞的生長增殖,且變化呈濃度依賴性,而不同濃度雷帕霉素作用不同時間后均對CNE1細(xì)胞無明顯抑制作用。同一濃度雷帕霉素處理24h后,對p RNAi-U6.1/sh RNA/STGC3/NP69、CNE2細(xì)胞的抑制率低于處理48h和72h的抑制率,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),而處理48h和72h的抑制率之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。8μmol/L雷帕霉素處理48h后,p RNAi-U6.1/sh RNA/STGC3/NP69、CNE2細(xì)胞遷移、侵襲能力均明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),但雷帕霉素對CNE1細(xì)胞遷移、侵襲能力無明顯影響。Western blot檢測結(jié)果顯示,雷帕霉素處理48h后,p RNAi-U6.1/sh RNA/STGC3/NP69細(xì)胞、CNE2細(xì)胞中P-p70S6K和cyclin D1的表達降低,但m TOR、p70S6K蛋白的表達無明顯變化;而8μmol/L雷帕霉素處理48h后,CNE1細(xì)胞中m TOR、p70S6K、P-p70S6K和cyclin D1的表達較處理前均無明顯變化;這些結(jié)果表明雷帕霉素能抑制p RNAi-U6.1/sh RNA/STGC3/NP69和CNE2細(xì)胞生長增殖及遷移、侵襲能力,可能與抑制其P-p70S6K和cyclin D1的表達有關(guān)。[結(jié)論]1)STGC3表達降低可導(dǎo)致NP69細(xì)胞呈現(xiàn)出部分惡性表型,同時伴隨m TOR、Beclin-1等83種蛋白質(zhì)表達發(fā)生改變。2)STGC3低表達導(dǎo)致NP69細(xì)胞呈現(xiàn)部分惡性特征,其機制可能與m TOR信號通路密切相關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R739.63

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本文編號：1696034