本文選題：胃癌　切入點：腫瘤微環(huán)境　出處：《南華大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：目的:胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一。本研究旨在尋找胃癌微環(huán)境中差異蛋白質(zhì)分子,并探討其表達(dá)調(diào)控的機制,揭示微環(huán)境在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用。方法:1.采用激光捕獲顯微切割(LCM)技術(shù),分別切取新鮮正常胃粘膜組織(NGM)和胃腺癌組織(GAC)中間質(zhì),獲取高純度的NGM和GAC間質(zhì)總蛋白質(zhì),同位素標(biāo)記(i TRAQ),結(jié)合二維液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜(2D LC-MS/MS)技術(shù),鑒定NGM和GAC間微環(huán)境中的差異表達(dá)蛋白質(zhì)分子。通過生物信息學(xué)方法,分析胃癌微環(huán)境蛋白質(zhì)分子間的相互作用。選取胃癌間質(zhì)中高表達(dá)蛋白質(zhì)(FN1和MCL1)和低表達(dá)蛋白質(zhì)(EMILIN1和COL1A1),運用Western blot和免疫組織化學(xué)染色方法,驗證NGM及GAC組織中蛋白質(zhì)組學(xué)實驗結(jié)果,分析GAC間質(zhì)差異表達(dá)蛋白質(zhì)分子的臨床病理學(xué)意義。2.蛋白質(zhì)組學(xué)實驗結(jié)果,經(jīng)生物信息軟件分析,篩尋調(diào)控GAC間質(zhì)差異蛋白質(zhì)分子表達(dá)的miRNAs。選取其中的miR-125b進行研究,采用q RT-PCR和原位雜交技術(shù),檢測miR-125b在NGM和GAC組織中的表達(dá),分析miR-125b表達(dá)與胃癌患者臨床病理及預(yù)后的關(guān)系;將miR-125b轉(zhuǎn)染于胃癌MGC-803細(xì)胞,通過細(xì)胞生長曲線繪制、Transwell侵襲、流式細(xì)胞儀、Western blot及裸鼠成瘤,分析miR-125b導(dǎo)入MGC-803細(xì)胞,對MGC-803細(xì)胞生長增殖、凋亡及侵襲的影響。Targetscan 6.2軟件分析,預(yù)測miR-125b可能參與調(diào)控胃癌的靶基因;采用熒光素酶基因報告檢測、q RT-PCR與Western blot方法,證實MCL1基因為miR-125b調(diào)控的靶基因;免疫組織化學(xué)染色,觀察注射miR-125b,荷瘤組織中MCL1表達(dá)水平;構(gòu)建MCL1干擾載體,采用生長曲線繪制、Transwell侵襲實驗、流式細(xì)胞儀與Western blot,觀察敲低MCL1基因表達(dá),對MGC-803細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲能力的影響。結(jié)果:1.本研究在胃癌間質(zhì)中總共鑒定出差異蛋白質(zhì)分子123個,其中表達(dá)上調(diào)56個,下調(diào)67個,這些蛋白質(zhì)涉及腫瘤相關(guān)的信號通路(如MAPK信號通路、VEF信號通路、p53信號通路等)、器官發(fā)育、細(xì)胞生長、增殖、凋亡、代謝、激應(yīng)、運輸及免疫等;部分蛋白質(zhì)在STRING網(wǎng)絡(luò)中呈現(xiàn)相互節(jié)點,兩兩間相互聯(lián)系;免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,EMILIN1和COL1A1蛋白質(zhì)在胃癌組織中低表達(dá),而MCL1和FN1蛋白質(zhì)則在胃癌組織中高表達(dá)。MCL1和FN1在胃癌中高表達(dá),與胃癌分化程度、腫塊大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期呈正相關(guān),與EMILIN1和COL1A1表達(dá)則呈負(fù)相關(guān)(P0.01)。2.通過生物信息學(xué)軟件,預(yù)測調(diào)控胃癌微環(huán)境差異蛋白質(zhì)分子的mic RNAs,分析顯示miR-125b調(diào)控多個蛋白質(zhì);miR-125b在胃癌組織中低表達(dá),其表達(dá)與胃癌組織的分化程度呈正相關(guān)(P0.01);miR-125b在TNM分期I-II期患者的陽性表達(dá)率高于III-IV期患者,與胃癌患者TNM分期呈負(fù)相關(guān)(P0.01);miR-125b表達(dá)與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)(P0.01);Kaplan-meier生存曲線分析顯示,miR-125b表達(dá)胃癌患者生存期相關(guān),miR-125b高表達(dá)患者生存期長于miR-125b低表達(dá)組,miR-125b表達(dá)低,患者預(yù)后差(P0.01)。3.miR-125b導(dǎo)入MGC-803細(xì)胞,細(xì)胞生長速度減慢,侵襲能力降低,細(xì)胞凋亡率增加,Cleaved caspase-3及Cleaved PARP表達(dá)增加(P0.01),裸鼠荷瘤體積變小、重量減輕(P0.01);MCL1是miR-125b的靶基因,核苷酸結(jié)合位點是MCL1基因3’UTR的2613-2620;miR-125b高表達(dá),MGC-803細(xì)胞MCL1基因表達(dá)降低(P0.01);敲低MCL1基因在MGC-803細(xì)胞的表達(dá),細(xì)胞生長速度減慢,侵襲能力降低,細(xì)胞凋亡增加,Cleaved caspase-3及Cleaved PARP表達(dá)增加(P0.01);注射miR-125b,可抑制裸鼠荷瘤生長,荷瘤組織內(nèi)MCL1蛋白質(zhì)的表達(dá)降低(P0.01)。結(jié)論:1.篩選胃癌微環(huán)境差異表達(dá)蛋白質(zhì)123個,其中上調(diào)56個,下調(diào)67個。2.miR-125b在胃癌組織中低表達(dá),其表達(dá)水平與胃癌分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后相關(guān)。3.miR-125b可抑制MCL1基因表達(dá),活化Caspase-3信號通路,降低MGC803細(xì)胞增殖與侵襲能力。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.2

【參考文獻】

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本文編號：1696062