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肝細(xì)胞癌和膽囊癌基因表達(dá)譜分析及肝癌相關(guān)基因單核苷酸多態(tài)性研究

發(fā)布時(shí)間:2018-04-01 01:37

  本文選題:AFP 切入點(diǎn):HNF1A 出處:《第二軍醫(yī)大學(xué)》2016年博士論文


【摘要】:第一部分肝癌相關(guān)AFP和HNF1A基因單核苷酸多態(tài)性研究單核苷酸多態(tài)性(SNP)是基因組水平上的DNA多態(tài)性,可發(fā)生在基因編碼區(qū)和非編碼區(qū),與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究在課題組前期原發(fā)性肝癌易感性基因系列研究基礎(chǔ)上,重點(diǎn)聚焦AFP和HNF1A基因非編碼區(qū)SNP位點(diǎn)多態(tài)性的研究,尋找這些位點(diǎn)與HCC易感性之間的關(guān)聯(lián),以及它們對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控機(jī)制。我們通過聚合酶鏈反應(yīng)-連接酶方法(Polymerase chain reaction Ligation detection reaction,PCR-LDR)對(duì)來自中國漢族人群的1058例樣本進(jìn)行了SNP位點(diǎn)基因型檢測(cè)。檢測(cè)的SNP位點(diǎn)包括:AFP基因SNP位點(diǎn)rs6834059、rs4018和rs4024,以及HNF1A基因SNP位點(diǎn)rs73539。通過病例對(duì)照研究,評(píng)估了這些位點(diǎn)與HBV感染以及HBV相關(guān)HCC之間的關(guān)聯(lián)性。然后,我們通過構(gòu)建rs4024和rs735396位點(diǎn)野生型和突變型的熒光報(bào)告載體,初步研究了它們對(duì)基因轉(zhuǎn)錄活性的影響。我們通過體外EMSA實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了它們對(duì)基因轉(zhuǎn)錄活性的影響。結(jié)果顯示AFP的SNP位點(diǎn)rs6834059和rs4024基因多態(tài)性分別與HCC患者是否伴有肝硬化和TNM分期存在統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)。rs6834059位點(diǎn)G/G基因型在伴有肝硬化的HCC患者中比例更高(P=0.038,OR=2.72,95%CI:1.02-7.26),而rs4024位點(diǎn)G/G基因型在高TNM分期的HCC患者中比例更高(P=0.031,OR=1.88,95%CI:1.05-3.37)。此外,rs735396位點(diǎn)多態(tài)性與HBV相關(guān)HCC易感性之間存在顯著相關(guān)性,攜帶A/A基因型人群具有更高的HCC患病風(fēng)險(xiǎn)(P=0.024,OR=1.55,95%CI:1.06 2.26)。熒光報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示rs4204位點(diǎn)G/G基因型和rs735396位點(diǎn)G/G基因型具有更高的轉(zhuǎn)錄活性。此外,EMSA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示rs4204位點(diǎn)G/G與A/A基因型之間結(jié)合所在調(diào)控序列的核蛋白能力存在差異。結(jié)論:通過病例對(duì)照研究,我們發(fā)現(xiàn)了AFP基因SNP位點(diǎn)rs735396多態(tài)性與HCC的易感性顯著相關(guān),而AFP基因SNP位點(diǎn)rs6834059和rs4024多態(tài)性與HCC的進(jìn)展顯著相關(guān)。進(jìn)一步功能學(xué)研究揭示了rs735396和rs4204位點(diǎn)多態(tài)性在基因轉(zhuǎn)錄中的調(diào)控作用。第二部分肝細(xì)胞癌與肝硬化基因表達(dá)譜差異分析肝硬化(Cirrhosis)是肝細(xì)胞癌(HCC)高危風(fēng)險(xiǎn)因素,易進(jìn)展為HCC并最終導(dǎo)致死亡。本研究旨在比較HCC和Cirrhosis組織之間的基因表達(dá)數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)從Cirrhosis演變?yōu)镠CC過程中的關(guān)鍵基因(Hub genes),以及這些基因在疾病過程中的作用。我們從高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(Gene expression Omnibus,GEO)下載了4個(gè)HCC和Cirrhosis相關(guān)數(shù)據(jù)集,并將HCC組織樣本和正常肝組織樣本數(shù)據(jù)合并為HCC數(shù)據(jù)集,將Cirrhosis組織樣本數(shù)據(jù)定義為C數(shù)據(jù)集合。然后,我們使用WGCNA軟件包構(gòu)建了HCC和C數(shù)據(jù)集的權(quán)重基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò),獲得顯著共表達(dá)的基因模塊,并通過flash Clust和dynamic Tree Cut軟件包對(duì)得到的基因模塊進(jìn)行了分析,根據(jù)連接度計(jì)算篩選到出Hub基因。最后,應(yīng)用DAVID在線數(shù)據(jù)庫對(duì)模塊特異性基因以及Yellow模塊中Hub基因進(jìn)行功能注釋,并通過Cytoscape軟件可視化顯示功能注釋網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果顯示在排除了離群樣本后,HCC數(shù)據(jù)集包含有394個(gè)HCC組織樣本和29正常肝組織樣本數(shù)據(jù),C數(shù)據(jù)集包含215個(gè)肝硬化組織樣本數(shù)據(jù)。HCC數(shù)據(jù)集構(gòu)建了6個(gè)基因模塊,分別標(biāo)記為:藍(lán)、棕、青綠、綠色、紅色和黃色。其中的藍(lán)、棕、青綠在HCC和C數(shù)據(jù)集之間具有高保守性,而黃色保守性最低。這些模塊中的基因已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)錄、有絲分裂、陽離子運(yùn)輸、陽離子穩(wěn)態(tài)以及環(huán)化酶的分泌和調(diào)控有關(guān)。黃色基因模塊中包含有編碼細(xì)胞因子的基因,例如:CCL22和IL19,這些細(xì)胞因子可在HCC的發(fā)生過程中起到重要的作用。結(jié)論:通過HCC與Cirrhosis組織基因表達(dá)譜的WGCNA比較分析,發(fā)現(xiàn)了6個(gè)顯著共表達(dá)的基因模塊,其中一個(gè)基因模塊可能與肝硬化進(jìn)展為HCC緊密相關(guān)。通過Hub基因分析,我們發(fā)現(xiàn)了一些在肝硬化和肝細(xì)胞癌之間差異表達(dá)的基因,它們可能是HCC進(jìn)展過程中發(fā)揮作用的重要因子。對(duì)這些基因進(jìn)一步的功能研究,將有助于我們更好地了解HCC發(fā)病的分子機(jī)制。第三部分基于RNA-Seq的膽囊癌轉(zhuǎn)錄組研究膽囊癌是一種相對(duì)少見的的惡性腫瘤,具有高惡性程度、易早期轉(zhuǎn)移、難于早期發(fā)現(xiàn)、對(duì)化療藥物不敏感等特點(diǎn)。本研究旨在通過對(duì)癌組織(TT)與癌旁組織(ANTT)之間差異表達(dá)基因(DEGs)的研究,發(fā)掘差異表達(dá)基因?qū)δ懩野┬纬珊桶l(fā)展的影響機(jī)制,為尋找新的診治靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。首先,我們從本實(shí)驗(yàn)室前期研究的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-Seq)數(shù)據(jù)中挑選了16個(gè)DEGs。然后,通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(Real-time PCR),在一個(gè)包含35例膽囊癌患者的獨(dú)立樣本中,對(duì)這些DEGs進(jìn)行了驗(yàn)證。而且,我們結(jié)合臨床隨訪信息,在差異表達(dá)基因與臨床數(shù)據(jù)之間進(jìn)行了關(guān)聯(lián)性分析。結(jié)果顯示其中有12個(gè)差異表達(dá)基因在驗(yàn)證組的表達(dá)數(shù)據(jù)與RNA-Seq數(shù)據(jù)一致。BIRC5、TK1、TNNT1和MMP9基因表達(dá)水平與膽囊癌手術(shù)后預(yù)后相關(guān)。BIRC5基因表達(dá)與TNM(tumor-node-metastasis)分期之間存在顯著相關(guān)性。此外,我們還發(fā)現(xiàn)血清CA19-9檢測(cè)值與TNNT1、MMP9和CLIC3基因表達(dá)水平之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性。生存分析結(jié)果顯示,TK1和MMP9基因高表達(dá)的膽囊癌患者,伴有更差的臨床預(yù)后。結(jié)論:通過對(duì)DEGs的研究,發(fā)現(xiàn)了一些與膽囊癌相關(guān)的重要DEGs。這些DEGs不僅具有成為膽囊癌診斷和預(yù)后相關(guān)生物學(xué)標(biāo)記的潛力,而且為我們發(fā)現(xiàn)新的腫瘤治療方法開拓了新思路。
[Abstract]:絎竴閮ㄥ垎鑲濈檶鐩稿叧AFP鍜孒NF1A鍩哄洜鍗曟牳鑻烽吀澶氭,

本文編號(hào):1693420

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