發(fā)布時間：2018-04-01 02:10

  本文選題：EGFR　切入點：自噬　出處：《河北醫(yī)科大學》2016年碩士論文

【摘要】：目的:本論文分為兩大部分,第一部分從基礎細胞實驗層面研究肺腺癌A549細胞中EGFR表達量與自噬活性的關系;第二部分從臨床實驗角度研究,肺腺癌患者胸水中癌細胞EGFR突變狀態(tài)與自噬活性是否相關。下面分別闡述:(一)研究顯示肺癌為全世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率極高的癌癥,通過特異性RNA干擾介導技術降低表皮生長因子受體EGFR的表達,來探究EGFR對肺腺癌A549細胞的自噬活性的影響,為肺癌實驗及臨床研究提供新的思路。(二)隨著對肺癌發(fā)生、發(fā)展中分子生物學機制、診斷和預后以及肺癌中癌基因突變的深入研究,目前輔助EGFR靶向治療的新型診斷方法已成為現(xiàn)階段研究的熱點,在此我們運用Real Time RT-PCR方法檢測肺腺癌患者胸水細胞,比較EGFR突變組與非突變組的自噬相關基因LC3和Beclin1的表達是否有差異,探索自噬活性與EGFR突變狀態(tài)是否相關,為臨床及實驗研究提供新的思路和突破點。方法:(一)1應用基因轉染技術,將EGFR特異性干擾RNA轉染入肺腺癌A549細胞中,應用Real Time RT-PCR(real time reverse transcription polymerase chain reaction)、Western-Blot方法檢測外源性EGFR特異性干擾RNA(EGFR si RNA)介導的表皮生長因子EGFR轉錄后的基因沉默效應。2選取處于對數(shù)生長期的肺腺癌A549細胞,將其接種于六孔板內(nèi),本實驗可分為四組:轉染EGFR si RNA組、轉染negative control si RNA組、轉染試劑組和正常組。經(jīng)si RNA轉染后,分組細胞皆經(jīng)適量濃度EGF處理半個小時后,應用Westrn-Blot方法檢測EGFR si RNA轉錄A549細胞前后自噬效應分子LC3蛋白表達水平的變化,并分析其與表皮生長因子受體EGFR之間相互作用的關系。3用透射電子顯微鏡(Transmission electron microscopy,TEM)對比觀察轉染EGFR特異性干擾RNA(EGFR si RNA)組和陰性對照組si RNA(control si RNA)組自噬小體的變化,判斷細胞內(nèi)自噬情況。(二)收集河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院癌檢中心2015年9月至2015年12月初診疑似肺癌患者胸水。1蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining,HE染色法)對患者胸水細胞涂片進行診斷篩查。2免疫細胞化學法(Immunochemistry,ICC)進一步診斷細胞涂片上癌細胞的類型。3 ARMS(amplification refractory mutation system)實時定量熒光PCR法擴增癌細胞檢測EGFR基因是否突變,進而把患者分為EGFR突變組與EGFR非突變組。4 Real Time RT-PCR方法檢測胸水中癌細胞中自噬效應分子LC3和Beclin1的m RNA水平,運用統(tǒng)計學方法比較EGFR基因突變組與EGFR非突變組自噬效應分子LC3與Beclin1是否有差異性。結果:(一)1 Western-Blot實驗結果顯示,在轉染EGFR特異性干擾RNA的A549細胞中,轉染EGFR特異性si RNA(1,3)后,表皮生長因子EGFR的蛋白水平上表達量均有明顯降低,具有統(tǒng)計學差異(P0.05),其表達下降量最為明顯的是EGFR si RNA-1。Real Time RT-PCR實驗結果顯示轉染EGFR si RNA-1后,EGFR的m RNA表達量顯著下降具有統(tǒng)計學差異(P0.05)。2 EGFR特異性si RNA(EGFR si RNA)沉默表皮生長因子EGFR后,Western-Blot結果表明在蛋白表達水平自噬特異性效應物LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著增加。3透射電子顯微鏡對比觀察轉染EGFR特異性si RNA(EGFR si RNA)組和陰性對照si RNA(control si RNA)組,結果顯示EGFRsi RNA組細胞中形成較多大量雙層膜包裹未被完全降解的細胞內(nèi)容物的自噬小體。(二)1 HE常規(guī)染色涂片分別經(jīng)兩位細胞病理學醫(yī)生初診,均可見豐富的惡性腫瘤細胞,細胞呈多形型,細胞核增大,染色質粗糙,核漿比增大,即可滿足進一步免疫細胞化學染色與ARMS法檢測的需要。2免疫細胞化學染色法中,肺腺癌特異性標記抗體TTF-1及Napsin A等在細胞學涂片中都表現(xiàn)為陽性,即通過免疫細胞化學染色進一步診斷患者胸水屬于肺腺癌。3 ARMS法檢測惡性胸水共計40例,其中檢測出EGFR非突變組15例,突變組25例。4 Real Time RT-PCR檢測突變組與非突變組中的自噬相關蛋白LC3在統(tǒng)計學上有顯著差異性,而Beclin1在統(tǒng)計學上無顯著差異性。結論:1特異性EGFR si RNA可有效發(fā)揮EGFR轉錄后基因沉默效應(PTGs,post-transcriptional gene silencing)。2應用特異性EGFR si RNA沉默表皮生長因子EGFR表達后,可提高人肺腺癌A549細胞自噬活性,說明EGFR的表達量與細胞自噬活性呈負相關性。3肺腺癌胸水細胞在EGFR突變與非突變狀態(tài)下的自噬活性有差異,非突變狀態(tài)下自噬活性高于突變狀態(tài)。4兩部分研究表明,肺腺癌細胞自噬活性不僅與EGFR的表達量有關,還與EGFR點突變狀態(tài)相關,為臨床肺腺癌研究與(靶向)治療提供新的思路與突破點。
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【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2

【參考文獻】

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1 Lihua Huang;Liwu Fu;;Mechanisms of resistance to EGFR tyrosine kinase inhibitors[J];Acta Pharmaceutica Sinica B;2015年05期

2 王賁士;陳德喜;郭洪亮;;自噬與腫瘤的研究現(xiàn)狀[J];中華腫瘤防治雜志;2014年08期

3 陳曦;梁文穎;熊靜波;;自噬的檢測方法及評述[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學進展;2012年09期

4 沈揚;梁立治;洪明晃;熊櫻;魏梅;朱孝峰;;微管相關蛋白LC3和自噬基因Beclin1在上皮性卵巢癌中的表達及其意義[J];癌癥;2008年06期

5 段振玲;彭芝蘭;王贊宏;閆乃紅;;自噬基因Beclin1與上皮性卵巢癌發(fā)生、發(fā)展的相關性研究[J];癌癥;2007年03期

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本文編號：1693490