本文選題：EGFR　切入點(diǎn)：自噬　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：目的:本論文分為兩大部分,第一部分從基礎(chǔ)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)層面研究肺腺癌A549細(xì)胞中EGFR表達(dá)量與自噬活性的關(guān)系;第二部分從臨床實(shí)驗(yàn)角度研究,肺腺癌患者胸水中癌細(xì)胞EGFR突變狀態(tài)與自噬活性是否相關(guān)。下面分別闡述:(一)研究顯示肺癌為全世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率極高的癌癥,通過特異性RNA干擾介導(dǎo)技術(shù)降低表皮生長因子受體EGFR的表達(dá),來探究EGFR對肺腺癌A549細(xì)胞的自噬活性的影響,為肺癌實(shí)驗(yàn)及臨床研究提供新的思路。(二)隨著對肺癌發(fā)生、發(fā)展中分子生物學(xué)機(jī)制、診斷和預(yù)后以及肺癌中癌基因突變的深入研究,目前輔助EGFR靶向治療的新型診斷方法已成為現(xiàn)階段研究的熱點(diǎn),在此我們運(yùn)用Real Time RT-PCR方法檢測肺腺癌患者胸水細(xì)胞,比較EGFR突變組與非突變組的自噬相關(guān)基因LC3和Beclin1的表達(dá)是否有差異,探索自噬活性與EGFR突變狀態(tài)是否相關(guān),為臨床及實(shí)驗(yàn)研究提供新的思路和突破點(diǎn)。方法:(一)1應(yīng)用基因轉(zhuǎn)染技術(shù),將EGFR特異性干擾RNA轉(zhuǎn)染入肺腺癌A549細(xì)胞中,應(yīng)用Real Time RT-PCR(real time reverse transcription polymerase chain reaction)、Western-Blot方法檢測外源性EGFR特異性干擾RNA(EGFR si RNA)介導(dǎo)的表皮生長因子EGFR轉(zhuǎn)錄后的基因沉默效應(yīng)。2選取處于對數(shù)生長期的肺腺癌A549細(xì)胞,將其接種于六孔板內(nèi),本實(shí)驗(yàn)可分為四組:轉(zhuǎn)染EGFR si RNA組、轉(zhuǎn)染negative control si RNA組、轉(zhuǎn)染試劑組和正常組。經(jīng)si RNA轉(zhuǎn)染后,分組細(xì)胞皆經(jīng)適量濃度EGF處理半個(gè)小時(shí)后,應(yīng)用Westrn-Blot方法檢測EGFR si RNA轉(zhuǎn)錄A549細(xì)胞前后自噬效應(yīng)分子LC3蛋白表達(dá)水平的變化,并分析其與表皮生長因子受體EGFR之間相互作用的關(guān)系。3用透射電子顯微鏡(Transmission electron microscopy,TEM)對比觀察轉(zhuǎn)染EGFR特異性干擾RNA(EGFR si RNA)組和陰性對照組si RNA(control si RNA)組自噬小體的變化,判斷細(xì)胞內(nèi)自噬情況。(二)收集河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院癌檢中心2015年9月至2015年12月初診疑似肺癌患者胸水。1蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining,HE染色法)對患者胸水細(xì)胞涂片進(jìn)行診斷篩查。2免疫細(xì)胞化學(xué)法(Immunochemistry,ICC)進(jìn)一步診斷細(xì)胞涂片上癌細(xì)胞的類型。3 ARMS(amplification refractory mutation system)實(shí)時(shí)定量熒光PCR法擴(kuò)增癌細(xì)胞檢測EGFR基因是否突變,進(jìn)而把患者分為EGFR突變組與EGFR非突變組。4 Real Time RT-PCR方法檢測胸水中癌細(xì)胞中自噬效應(yīng)分子LC3和Beclin1的m RNA水平,運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法比較EGFR基因突變組與EGFR非突變組自噬效應(yīng)分子LC3與Beclin1是否有差異性。結(jié)果:(一)1 Western-Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在轉(zhuǎn)染EGFR特異性干擾RNA的A549細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染EGFR特異性si RNA(1,3)后,表皮生長因子EGFR的蛋白水平上表達(dá)量均有明顯降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),其表達(dá)下降量最為明顯的是EGFR si RNA-1。Real Time RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染EGFR si RNA-1后,EGFR的m RNA表達(dá)量顯著下降具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。2 EGFR特異性si RNA(EGFR si RNA)沉默表皮生長因子EGFR后,Western-Blot結(jié)果表明在蛋白表達(dá)水平自噬特異性效應(yīng)物L(fēng)C3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著增加。3透射電子顯微鏡對比觀察轉(zhuǎn)染EGFR特異性si RNA(EGFR si RNA)組和陰性對照si RNA(control si RNA)組,結(jié)果顯示EGFRsi RNA組細(xì)胞中形成較多大量雙層膜包裹未被完全降解的細(xì)胞內(nèi)容物的自噬小體。(二)1 HE常規(guī)染色涂片分別經(jīng)兩位細(xì)胞病理學(xué)醫(yī)生初診,均可見豐富的惡性腫瘤細(xì)胞,細(xì)胞呈多形型,細(xì)胞核增大,染色質(zhì)粗糙,核漿比增大,即可滿足進(jìn)一步免疫細(xì)胞化學(xué)染色與ARMS法檢測的需要。2免疫細(xì)胞化學(xué)染色法中,肺腺癌特異性標(biāo)記抗體TTF-1及Napsin A等在細(xì)胞學(xué)涂片中都表現(xiàn)為陽性,即通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色進(jìn)一步診斷患者胸水屬于肺腺癌。3 ARMS法檢測惡性胸水共計(jì)40例,其中檢測出EGFR非突變組15例,突變組25例。4 Real Time RT-PCR檢測突變組與非突變組中的自噬相關(guān)蛋白LC3在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異性,而Beclin1在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著差異性。結(jié)論:1特異性EGFR si RNA可有效發(fā)揮EGFR轉(zhuǎn)錄后基因沉默效應(yīng)(PTGs,post-transcriptional gene silencing)。2應(yīng)用特異性EGFR si RNA沉默表皮生長因子EGFR表達(dá)后,可提高人肺腺癌A549細(xì)胞自噬活性,說明EGFR的表達(dá)量與細(xì)胞自噬活性呈負(fù)相關(guān)性。3肺腺癌胸水細(xì)胞在EGFR突變與非突變狀態(tài)下的自噬活性有差異,非突變狀態(tài)下自噬活性高于突變狀態(tài)。4兩部分研究表明,肺腺癌細(xì)胞自噬活性不僅與EGFR的表達(dá)量有關(guān),還與EGFR點(diǎn)突變狀態(tài)相關(guān),為臨床肺腺癌研究與(靶向)治療提供新的思路與突破點(diǎn)。
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【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

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本文編號：1693490