本文關(guān)鍵詞：腫瘤相關(guān)巨噬細胞促進膠質(zhì)瘤干細胞侵襲及其機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。
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腫瘤相關(guān)巨噬細胞促進膠質(zhì)瘤干細胞侵襲及其機制研究
葉顯宗；
知網(wǎng)
原文摘要
在成人原發(fā)性腦腫瘤中，惡性膠質(zhì)瘤是較為常見的。由于惡性膠質(zhì)瘤具有侵襲性強的特點，致使神經(jīng)外科手術(shù)無法完全切除，而后續(xù)進行的放療和化療又難以徹底地消除殘存腫瘤細胞，這些細胞最終引起腫瘤的復(fù)發(fā)，導(dǎo)致患者預(yù)后差，死亡率高。近年來，腫瘤干細胞（cancer stem cells, CSCs）理論的提出，促使研究者重新審視惡性膠質(zhì)瘤及其生物學(xué)特性。我室和同行的研究表明，惡性膠質(zhì)瘤中存在膠質(zhì)瘤干細胞（glioma stem cells, GSCs），這群細胞在膠質(zhì)瘤中含量甚微，但卻有很強的自我更新和多向分化能力，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中都起著關(guān)鍵作用。研究這群細胞的生物學(xué)特性，對認(rèn)識惡性膠質(zhì)瘤侵襲性生長的特點具有重要意義。已有研究證據(jù)表明炎癥細胞參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。腫瘤的免疫微環(huán)境及其中浸潤的各種免疫細胞參與了腫瘤發(fā)生演進的諸多方面，如血管生成、免疫抑制、侵襲轉(zhuǎn)移等。在這些浸潤免疫細胞中，腫瘤相關(guān)巨噬細胞（tumor associated macrophages, TAMs）所占的比例較高，也是最為重要的一個亞群。然而，關(guān)于腫瘤免疫微環(huán)境及其中浸潤的免疫細胞，如TAMs，對CSCs生物學(xué)特性的影響尚有待深入研究。為探討TAMs在GSCs侵襲性生長中的作用及其機制，本研究首先以CD133作為標(biāo)志物，從原代膠質(zhì)母細胞瘤標(biāo)本和小鼠惡性膠質(zhì)瘤細胞系GL261移植瘤中分離并鑒定了GSCs；進一步，我們從惡性膠質(zhì)瘤動物模型中成功分離了浸潤的TAMs，并對其表型進行了鑒定；然后，我們分別在惡性膠質(zhì)瘤臨床標(biāo)本和動物模型中觀察了TAMs與GSCs的空間分布特點，并檢測了TAMs對GSCs侵襲的影響；最后，我們研究了TGF-β1信號通路及其受體，轉(zhuǎn)化生長因子-β Ⅱ型受體（type Ⅱ TGF-β receptor，TGFBR2）在TAMs促進GSCs侵襲性生長中的作用并探索了其中可能的治療干預(yù)靶點。研究內(nèi)容及主要結(jié)果和結(jié)論如下：1.成功分離并鑒定惡性膠質(zhì)瘤中的GSCs：①人原代惡性膠質(zhì)瘤標(biāo)本中CD133~+細胞的比例具有異質(zhì)性特點。應(yīng)用流式分析方法檢測5例人原代惡性膠質(zhì)瘤標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，其中CD133~+細胞比例分布在0.1%~14.6%之間。②移植瘤中CD133~+細胞的比例顯著增高，并呈穩(wěn)態(tài)。與體外培養(yǎng)的小鼠膠質(zhì)瘤細胞系GL261相比，其移植瘤中CD133~+細胞的比例顯著增高（1.83%±0.5%vs.0.68%±0.46%, p<0.01）；而GL261細胞系移植瘤與分選所得CD133~+細胞所接種的移植瘤中，CD133~+細胞的比例差異不明顯（1.83%±0.5%vs.2.05%±0.52%, p>0.05）。③經(jīng)過流式分選所得的CD133~+細胞的純度可以達到80%以上，并且在無血清神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基中具有連續(xù)成球能力。④CD133~+細胞的平板克隆形成能力顯著性強于CD133－細胞。⑤CD133~+細胞相比CD133－細胞，高表達干細胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Sox2及神經(jīng)干細胞標(biāo)志物nestin，低表達星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞的分化標(biāo)志物GFAP和MBP。⑥CD133~+細胞具有多向分化能力，能誘導(dǎo)分化成表達GFAP、MBP或者β-tubulin Ⅲ的細胞。 ⅢCD133~+細胞相比CD133－細胞具有更強的成瘤能力，僅1×103個CD133~+細胞即可在對應(yīng)的動物模型中成瘤，然而GL261細胞系移植瘤和兩例人原代惡性膠質(zhì)瘤標(biāo)本來源的CD133－細胞分別需要1×104和5×105個才能成瘤。2.發(fā)現(xiàn)惡性膠質(zhì)瘤中浸潤的TAMs呈促進腫瘤生長的M2表型：①TAMs是惡性膠質(zhì)瘤浸潤免疫細胞中的重要群體之一。流式分析顯示，惡性膠質(zhì)瘤細胞系GL261移植瘤中浸潤的所有免疫細胞，即CD45+細胞群體，在總細胞所占的比例約9.3%±2.7%；而浸潤的巨噬細胞，即CD11b+細胞群體，所占總細胞的比例可以達到6.8%±1.1%；此外，在人膠質(zhì)母細胞瘤臨床標(biāo)本中，亦可以看到有大量CD68+細胞的分布，特別是在腫瘤侵襲的邊緣區(qū)域。②應(yīng)用流式分選的方法，從GL261細胞系移植瘤中可分離得到高純度的CD11b+F4/80+細胞（94.6%），即TAMs；并且這群細胞在光鏡下呈圓形或者卵圓形的典型巨噬細胞形態(tài)；激光共聚焦顯微鏡觀察，可見到CD11b抗原表達于細胞膜表面。③從正常小鼠脾臟中分離得到與TAMs具有相同表型的正常CD11b+F4/80+巨噬細胞（macrophages，Mφ）。④在未給予任何處理，或者給予IL-4（20ng/ml）、LPS（100ng/ml）聯(lián)合IFN-γ（20ng/ml）處理三種條件下，TAMs均表現(xiàn)為高分泌IL-10、TGF-β1等M2表型相關(guān)細胞因子，低表達IL-1β、IL-6、IL-12p40和TNF-α等M1表型相關(guān)細胞因子，說明TAMs是極化了的M2巨噬細胞。3. GSCs在惡性膠質(zhì)瘤的侵襲邊緣區(qū)域的分布TAMs在該區(qū)域的分布密切相關(guān)；分離得到的TAMs具有促進CD133~+GSCs侵襲的作用，TGF-β1是其關(guān)鍵分子：①觀察人惡性膠質(zhì)母細胞瘤臨床標(biāo)本及小鼠惡性膠質(zhì)瘤動物模型發(fā)現(xiàn)，在腫瘤侵襲的邊緣區(qū)域，CD68+TAMs與CD133~+GSCs存在共分布的情況，并且TGF-β1的分布區(qū)域與CD68+TAMs的分布一致。②與TAMs共培養(yǎng)對CD133~+和CD133－膠質(zhì)瘤細胞的遷移無明顯影響（p>0.05）。③與TAMs共培養(yǎng)可顯著性增強CD133~+GSCs的侵襲能力（p<0.01）,而CD133－細胞在與TAMs共培養(yǎng)后，其侵襲能力僅有略微升高（p<0.05）。④在與TAMs的共培養(yǎng)體系中使用TGF-β1中和抗體后，TAMs促進GSCs侵襲的效應(yīng)顯著性地被抑制（p<0.01），而TGF-β1中和抗體對CD133－細胞的侵襲無明顯影響（p>0.05）。⑤使用人重組TGF-β1預(yù)先處理兩例人原代惡性膠質(zhì)母細胞瘤來源的CD133~+細胞和CD133－細胞，可顯著性地增強CD133~+GSCs的侵襲能力（p<0.01），而TGF-β1預(yù)處理對CD133－細胞侵襲的影響較為微弱（p<0.05）。4. GSCs優(yōu)勢性高表達TGFBR2，該受體的活化促進GSCs分泌MMP-9，這在TAMs介導(dǎo)的GSCs侵襲過程中發(fā)揮重要作用：①應(yīng)用Real-time PCR和Western Blot的方法檢測發(fā)現(xiàn)，與CD133－細胞相比，CD133~+GSCs優(yōu)勢性高表達TGFBR2。②R eal-timePCR檢測發(fā)現(xiàn)，與CD133－細胞相比，CD133~+GSCs表達更多的與侵襲密切相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）。③與TAMs共培養(yǎng)，上調(diào)CD133~+GSCs中MMP-9的表達水平；在共培養(yǎng)體系中使用TGF-β1中和抗體，可減少TAMs促進MMP-9分泌的效果。④使用TGF-β1預(yù)處理，增加人惡性膠質(zhì)母細胞瘤來源的CD133~+GSCs中MMP-9的表達水平。5.干預(yù)TGF-β1信號通路和敲低TGFBR2均能顯著性下調(diào)MMP-9的表達水平，并在體內(nèi)外實驗中抑制GSCs的侵襲性生長：①在共培養(yǎng)體系中預(yù)先使用SIS3（Smad3抑制劑）或者SB203580（MAPK/p38抑制劑）均可下調(diào)CD133~+GSCs中MMP-9的表達水平（p<0.01），并抑制GSCs的侵襲（p<0.01）。②應(yīng)用shRNA干擾技術(shù)，可下調(diào)TGFBR2的表達（61%），，進一步減少CD133~+GSCs中MMP-9的表達水平（p<0.01）。③應(yīng)用shRNA干擾技術(shù)下調(diào)TGFBR2表達后，CD133~+GSCs侵襲能力顯著性下降（p<0.01），而CD133－細胞的侵襲未有明顯改變（p>0.05）。④應(yīng)用shRNA干擾技術(shù)下調(diào)TGFBR2表達后，與Mock對照組相比，CD133~+GSCs所形成的顱內(nèi)原位移植瘤侵襲能力明顯減弱，腫瘤侵襲邊緣區(qū)域CD133~+GSCs的分布亦有顯著性減少（p<0.01）。綜上所述，本研究的主要結(jié)論為：腫瘤侵襲前沿區(qū)域TAMs的分布，與GSCs的侵襲性生長有密切的關(guān)系；發(fā)生M2極化的TAMs主要通過旁分泌TGF-β1來促進GSCs的侵襲性生長；GSCs優(yōu)勢性高表達TGF-β1受體TGFBR2，是TAMs發(fā)揮促進GSCs侵襲的重要介導(dǎo)分子；TGFBR2的活化，可以上調(diào)GSCs中MMP-9的表達水平，進而促進GSCs的侵襲；使用TGF-β1信號通路的特異性抑制劑或者下調(diào)TGFBR2的表達，均能有效的抑制GSCs的侵襲性生長。上述研究結(jié)果表明，以TGF-β1信號通路及其受體TGFBR2為治療靶點，對遏制惡性膠質(zhì)瘤的侵襲性生長具有重要意義。
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