本文選題：胰腺癌　切入點：miR-615-5p　出處：《南京醫(yī)科大學》2016年博士論文

【摘要】：背景：胰腺癌的病死率高,手術是胰腺癌治療的最佳選擇,但診斷明確時,可切除病例只有80%,大部分已經診斷為晚期、無手術機會,而且五年生存率低于5%。因此,迫切需要討論其分子發(fā)病機制�；虻淖儺�、非正常的轉錄翻譯、甲基化異常等均可導致miRNA在腫瘤中異常表達,大部分miRNA可以做為抑癌基因或癌基因起著抑制腫瘤或致癌的作用,或調控細胞周期進程、分化或凋亡,或影響腫瘤細胞增殖。目的：1、探討胰腺癌中啟動子區(qū)異常甲基化的miRNA,研究在胰腺癌細胞中異常甲基化的miRNA的表達情況,探索在胰腺癌細胞中,miRNA表達受DNA高甲基化的影響情況,檢測25對胰腺癌及癌旁組織中miR-615-5p的表達。2、應用組織芯片miR-615-5p原位雜交探討miR-615-5p在胰腺癌組織中的表達情況,并研究miRNA的表達與相關臨床病理、預后的關系。3、研究miR-615-5p的下游靶基因及相關富集的信號通路分析,探討miR-615-5p在胰腺癌細胞中的相關功能。方法：1、應用甲基化芯片及免疫共沉淀的方法篩查胰腺癌細胞及正常胰腺組織中具有甲基化峰值的微小RNA,應用定量PCR對比正常胰腺組織和胰腺癌細胞株中miR-615-5p的表達量差異。對于胰腺癌細胞株應用去甲基化藥物處理, 定量PCR分析去甲基化處理前后miR-615-5p差異的表達。定量PCR檢測25對胰腺癌及癌旁組織中miR-615-5p表達量。2、將102對塊蠟塊應用組織芯片儀構建組織芯片(1對包括1例胰腺癌組織及對應的1例癌旁組織),應用原位雜交技術檢測102對胰腺癌組織及癌旁組織中miR-615-5p的表達；根據(jù)組織芯片miR-615-5p原位雜交的結果,闡述miR-615-5p的表達與病例臨床病理資料的關系；進一步分析胰腺癌組織中miR-615-5p的表達對預后的影響,應用Kaplan-meier法比較分析miR-615-5p于胰腺癌患者術后生存時間的相關性,應用Cox回歸分析患者生存時間的影響因素。3、構建穩(wěn)定過表達miR-615-5p的胰腺癌細胞株,分別用EdU、MTT、Transwell侵襲實驗、劃痕實驗、流式細胞儀于體外評價過表達miR-615-5p胰腺癌細胞的增殖、活力、侵襲、遷移能力及細胞周期和細胞凋亡情況；分析miR-615-5p過表達胰腺癌細胞株mRNA表達譜芯片測序結果,下調基因與多個miRNA靶基因軟件分析系統(tǒng)(TargetScan等)預測的miR-615-5p調控基因綜合分析比較,獲得交集基因、預測下游靶基因；分析miR-615-5p調控的基因相關網(wǎng)絡與信號通路。結果：1、DNA甲基化芯片結合甲基化DNA免疫共沉淀提示：胰腺組織和胰腺癌細胞中共有8個存在甲基化峰值的微小RNA：miRNA-615,miRNA-663b, miRNA-574,miRNA-1826,miRNA-1247, miRNA-675,miRNA-483,miRNA-663; BSP+TA克隆測序進行驗證篩選結果是：PANC-1中miRNA-615的甲基化率明顯高于正常胰腺組織。通過定量PCR對比正常胰腺組織,miR-615-5p在胰腺癌細胞株表達量降低。去甲基化藥物處理的胰腺癌細胞株中,miR-615-5p重新恢復表達。以正常胰腺組織為參照,與癌旁組織比較,miR-615-5p在21對胰腺癌組織中低表達。2、根據(jù)我們試驗的要求制作2張組織微陣列,微陣列分布整齊,發(fā)現(xiàn)3個脫點,所以位點上的組織均有意義,共102對胰腺癌組織及對應癌旁組織,HE染色及原位雜交染色均滿意。運用原位雜交技術檢測miR-615-5p結果顯示：與胰腺癌組織相比,miR-615-5p在胰腺癌旁組織中表達明顯增高,有顯著差異(P0.05)。miR-615-5p與患者年齡、性別、淋巴結侵犯及神經侵犯情況之間均無明顯相關性(P0.05)。miR-615-5p的表達與腫瘤分化程度、腫瘤大小分級、有無血管侵犯之間有明顯相關性(P0.05)。miR-615-5p染色強的患者術后生存時間明顯增長,將miR-615-5p代入由臨床參數(shù)構建模型中表明：miR-615-5p是與胰腺癌患者生存時限有相關性的相對獨立因素。3、EdU染色發(fā)現(xiàn)miR-615-5p使胰腺癌細胞的增殖能力下降,MTT結果提示miR-615-5p抑制SW1990細胞的活力,Transwell實驗提示miR-615-5p降低了SW1990細胞的侵襲能力,劃痕實驗提示miR-615-5p降低了SW1990細胞的遷移能力。miR-615-5p表達譜芯片測序結果顯示,與GFP control轉染組比較,miR-615-5p穩(wěn)染的SW1990細胞株中分別有319個基因表達下調。miR-615-5p穩(wěn)染SW1990細胞株與對照組比較下調基因與]miRNA調控靶點分析系統(tǒng)預測的miR-615-5p調控基因綜合比較,獲得14個交集基因。生物信息學軟件分析指出14個差異表達基因相關信號通路包括P13K信號傳導途徑、RAP1信號通路、癌癥通路、神經活性配體受體相互作用、縫隙連接等；縫隙連接是顯著性富集的信號通路。結論：1、與正常胰腺組織對照,miR-615-5p在胰腺癌細胞中的表達降低,基因啟動子區(qū)異常甲基化可能成為miR-615-5p異常表達的一個重要機制。。2、在組織芯片上應用miR-615-5p原位雜交技術,可以定性同時半定量反映miRNA在組織中的表達。原位雜交檢測miR-615-5p的表達在鑒別胰腺癌與正常胰腺組織時有較高的精確性、特異性,對胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展有重要意義。3、miR-615-5p對于胰腺癌細胞的增殖、活力、侵襲及遷移能力有抑制作用。以高通量mRNA表達譜芯片測序為基礎,應用生物信息學的方法,建立多元化的胰腺癌篩選的miR-615-5p相關調控的基因網(wǎng)絡,分析相關信號通路,為后來的廣泛深入的機制研究提供了便利。
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【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.9

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1 李偉;miR-615-5p在胰腺癌中的作用及調節(jié)機制研究[D];南京醫(yī)科大學;2016年

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本文編號：1675639