本文選題：胰腺癌　切入點(diǎn)：miR-615-5p　出處：《南京醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：背景：胰腺癌的病死率高,手術(shù)是胰腺癌治療的最佳選擇,但診斷明確時(shí),可切除病例只有80%,大部分已經(jīng)診斷為晚期、無(wú)手術(shù)機(jī)會(huì),而且五年生存率低于5%。因此,迫切需要討論其分子發(fā)病機(jī)制。基因的變異、非正常的轉(zhuǎn)錄翻譯、甲基化異常等均可導(dǎo)致miRNA在腫瘤中異常表達(dá),大部分miRNA可以做為抑癌基因或癌基因起著抑制腫瘤或致癌的作用,或調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程、分化或凋亡,或影響腫瘤細(xì)胞增殖。目的：1、探討胰腺癌中啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化的miRNA,研究在胰腺癌細(xì)胞中異常甲基化的miRNA的表達(dá)情況,探索在胰腺癌細(xì)胞中,miRNA表達(dá)受DNA高甲基化的影響情況,檢測(cè)25對(duì)胰腺癌及癌旁組織中miR-615-5p的表達(dá)。2、應(yīng)用組織芯片miR-615-5p原位雜交探討miR-615-5p在胰腺癌組織中的表達(dá)情況,并研究miRNA的表達(dá)與相關(guān)臨床病理、預(yù)后的關(guān)系。3、研究miR-615-5p的下游靶基因及相關(guān)富集的信號(hào)通路分析,探討miR-615-5p在胰腺癌細(xì)胞中的相關(guān)功能。方法：1、應(yīng)用甲基化芯片及免疫共沉淀的方法篩查胰腺癌細(xì)胞及正常胰腺組織中具有甲基化峰值的微小RNA,應(yīng)用定量PCR對(duì)比正常胰腺組織和胰腺癌細(xì)胞株中miR-615-5p的表達(dá)量差異。對(duì)于胰腺癌細(xì)胞株應(yīng)用去甲基化藥物處理, 定量PCR分析去甲基化處理前后miR-615-5p差異的表達(dá)。定量PCR檢測(cè)25對(duì)胰腺癌及癌旁組織中miR-615-5p表達(dá)量。2、將102對(duì)塊蠟塊應(yīng)用組織芯片儀構(gòu)建組織芯片(1對(duì)包括1例胰腺癌組織及對(duì)應(yīng)的1例癌旁組織),應(yīng)用原位雜交技術(shù)檢測(cè)102對(duì)胰腺癌組織及癌旁組織中miR-615-5p的表達(dá)；根據(jù)組織芯片miR-615-5p原位雜交的結(jié)果,闡述miR-615-5p的表達(dá)與病例臨床病理資料的關(guān)系；進(jìn)一步分析胰腺癌組織中miR-615-5p的表達(dá)對(duì)預(yù)后的影響,應(yīng)用Kaplan-meier法比較分析miR-615-5p于胰腺癌患者術(shù)后生存時(shí)間的相關(guān)性,應(yīng)用Cox回歸分析患者生存時(shí)間的影響因素。3、構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-615-5p的胰腺癌細(xì)胞株,分別用EdU、MTT、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞儀于體外評(píng)價(jià)過(guò)表達(dá)miR-615-5p胰腺癌細(xì)胞的增殖、活力、侵襲、遷移能力及細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡情況；分析miR-615-5p過(guò)表達(dá)胰腺癌細(xì)胞株mRNA表達(dá)譜芯片測(cè)序結(jié)果,下調(diào)基因與多個(gè)miRNA靶基因軟件分析系統(tǒng)(TargetScan等)預(yù)測(cè)的miR-615-5p調(diào)控基因綜合分析比較,獲得交集基因、預(yù)測(cè)下游靶基因；分析miR-615-5p調(diào)控的基因相關(guān)網(wǎng)絡(luò)與信號(hào)通路。結(jié)果：1、DNA甲基化芯片結(jié)合甲基化DNA免疫共沉淀提示：胰腺組織和胰腺癌細(xì)胞中共有8個(gè)存在甲基化峰值的微小RNA：miRNA-615,miRNA-663b, miRNA-574,miRNA-1826,miRNA-1247, miRNA-675,miRNA-483,miRNA-663; BSP+TA克隆測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證篩選結(jié)果是：PANC-1中miRNA-615的甲基化率明顯高于正常胰腺組織。通過(guò)定量PCR對(duì)比正常胰腺組織,miR-615-5p在胰腺癌細(xì)胞株表達(dá)量降低。去甲基化藥物處理的胰腺癌細(xì)胞株中,miR-615-5p重新恢復(fù)表達(dá)。以正常胰腺組織為參照,與癌旁組織比較,miR-615-5p在21對(duì)胰腺癌組織中低表達(dá)。2、根據(jù)我們?cè)囼?yàn)的要求制作2張組織微陣列,微陣列分布整齊,發(fā)現(xiàn)3個(gè)脫點(diǎn),所以位點(diǎn)上的組織均有意義,共102對(duì)胰腺癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織,HE染色及原位雜交染色均滿意。運(yùn)用原位雜交技術(shù)檢測(cè)miR-615-5p結(jié)果顯示：與胰腺癌組織相比,miR-615-5p在胰腺癌旁組織中表達(dá)明顯增高,有顯著差異(P0.05)。miR-615-5p與患者年齡、性別、淋巴結(jié)侵犯及神經(jīng)侵犯情況之間均無(wú)明顯相關(guān)性(P0.05)。miR-615-5p的表達(dá)與腫瘤分化程度、腫瘤大小分級(jí)、有無(wú)血管侵犯之間有明顯相關(guān)性(P0.05)。miR-615-5p染色強(qiáng)的患者術(shù)后生存時(shí)間明顯增長(zhǎng),將miR-615-5p代入由臨床參數(shù)構(gòu)建模型中表明：miR-615-5p是與胰腺癌患者生存時(shí)限有相關(guān)性的相對(duì)獨(dú)立因素。3、EdU染色發(fā)現(xiàn)miR-615-5p使胰腺癌細(xì)胞的增殖能力下降,MTT結(jié)果提示miR-615-5p抑制SW1990細(xì)胞的活力,Transwell實(shí)驗(yàn)提示miR-615-5p降低了SW1990細(xì)胞的侵襲能力,劃痕實(shí)驗(yàn)提示miR-615-5p降低了SW1990細(xì)胞的遷移能力。miR-615-5p表達(dá)譜芯片測(cè)序結(jié)果顯示,與GFP control轉(zhuǎn)染組比較,miR-615-5p穩(wěn)染的SW1990細(xì)胞株中分別有319個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。miR-615-5p穩(wěn)染SW1990細(xì)胞株與對(duì)照組比較下調(diào)基因與]miRNA調(diào)控靶點(diǎn)分析系統(tǒng)預(yù)測(cè)的miR-615-5p調(diào)控基因綜合比較,獲得14個(gè)交集基因。生物信息學(xué)軟件分析指出14個(gè)差異表達(dá)基因相關(guān)信號(hào)通路包括P13K信號(hào)傳導(dǎo)途徑、RAP1信號(hào)通路、癌癥通路、神經(jīng)活性配體受體相互作用、縫隙連接等；縫隙連接是顯著性富集的信號(hào)通路。結(jié)論：1、與正常胰腺組織對(duì)照,miR-615-5p在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)降低,基因啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化可能成為miR-615-5p異常表達(dá)的一個(gè)重要機(jī)制。。2、在組織芯片上應(yīng)用miR-615-5p原位雜交技術(shù),可以定性同時(shí)半定量反映miRNA在組織中的表達(dá)。原位雜交檢測(cè)miR-615-5p的表達(dá)在鑒別胰腺癌與正常胰腺組織時(shí)有較高的精確性、特異性,對(duì)胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展有重要意義。3、miR-615-5p對(duì)于胰腺癌細(xì)胞的增殖、活力、侵襲及遷移能力有抑制作用。以高通量mRNA表達(dá)譜芯片測(cè)序?yàn)榛A(chǔ),應(yīng)用生物信息學(xué)的方法,建立多元化的胰腺癌篩選的miR-615-5p相關(guān)調(diào)控的基因網(wǎng)絡(luò),分析相關(guān)信號(hào)通路,為后來(lái)的廣泛深入的機(jī)制研究提供了便利。
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【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.9

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1 李偉;miR-615-5p在胰腺癌中的作用及調(diào)節(jié)機(jī)制研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2016年

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本文編號(hào)：1675639