本文選題：口腔鱗狀細胞癌　切入點：前列腺素E2　出處：《南方醫(yī)科大學》2017年博士論文

【摘要】：口腔鱗狀細胞癌(Oral Squamous Cell Carcinoma,OSCC)是臨床上常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率在全球呈現(xiàn)逐年上升的趨勢。在過去的20年中,盡管針對OSCC的治療方法不斷發(fā)展,但OSCC的五年生存率無明顯改善,因此發(fā)病機制、診斷及治療仍是OSCC的研究熱點。近年來,腫瘤微環(huán)境中炎癥與惡性腫瘤關系的研究備受關注,尤其是環(huán)氧化酶(Cyclooxygenase,COX)通路在介導炎癥和癌癥關系中的作用值得深入探究。研究表明,COX-2過表達與口腔癌的發(fā)生、侵襲以及化療藥物的耐藥性相關,而針對COX-2的非類固醇消炎藥(Nonsteroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs)可以抑制惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展,但它的長期使用會產生諸多副作用如胃潰瘍和心肌梗死等,臨床應用受限。前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)是COX-2通路的下游產物。研究表明,PGE2能促進多種惡性腫瘤的增殖及侵襲,其機制可能為抑制局部免疫反應。然而,PGE2及其受體4亞型(E-prostaglandin,EP4)對OSCC生物學特性的影響及機制尚未完全明了。為此,我們通過在OSCC細胞株中外源性添加PGE2及相應的拮抗劑來研究PGE2對OSCC細胞增殖及凋亡的影響并探討其可能的機制,從而尋找OSCC治療的潛在靶點。(1)我們采用cellcounting kit 8(CCK8)法檢測外源源性PGE2對OSCC細胞株Tca8113增殖活性的影響,發(fā)現(xiàn)在作用48 h時,PGE2能顯著地促進細胞增殖,效應呈現(xiàn)劑量依賴趨勢,且在PGE2濃度為1.0μmol/L時出現(xiàn)峰值。(2)采取Western-blot(WB)的方法研究PGE2促Tca8113細胞增殖的作用機制,我們發(fā)現(xiàn),外源性添加PGE2可激活ERK的磷酸化,而磷酸化過程可被MEK的抑制劑U0126拮抗;通過CCK8檢測Tca8113細胞增殖,我們發(fā)現(xiàn),外源性的U0126能拮抗PGE2對Tca8113細胞增殖的促進作用;上述結果表明PGE2可通過激活ERK的磷酸化促進Tca8113細胞的增殖。(3)WB法檢測顯示,4種類型的EP受體在Tca8113細胞中均有表達。(4)為確定與PGE2結合的EP受體類型,我們分別加入EP1、EP2及EP4受體拮抗劑,結果表明,EP4拮抗劑L-161,982可拮抗PGE2對Tca8113細胞的增殖作用,并呈現(xiàn)劑量和時間依賴性;進一步采用WB法檢測,我們發(fā)現(xiàn),L-161,982通過抑制PGE2對ERK磷酸化的促進作用,從而發(fā)揮拮抗作用,這也同樣驗證了 PGE2是通過激活ERK的磷酸化來促進細胞增殖。(5)為了進一步驗證PGE 2是否通過結合受體EP4而起作用,我們在細胞中加入3種類型的EP受體激動劑,結果發(fā)現(xiàn),僅有EP4激動劑PGE1-OH可以恢復被塞來昔布預處理的Tca8113細胞的增殖,并具有濃度依賴性趨勢;進一步采用WB法,我們發(fā)現(xiàn),PGE1-OH通過激活ERK磷酸化來促進細胞增殖,而MEK的抑制劑U0126可抑制此作用,提示PGE2可能通過結合受體EP4來促進細胞增殖的。(6)流式細胞儀檢測顯示,L-161,982可以誘導Tca8113細胞凋亡,并通過阻斷s期來影響細胞周期,其作用具有濃度依賴趨勢;WB法進一步檢測發(fā)現(xiàn),L-161,982通過上調Bax和下調Bcl-2蛋白水平來誘導細胞凋亡,同時通過上調P21和下調CDK2及CyclinA2的蛋白表達影響細胞周期。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)PGE2可通過結合受體EP4來介導ERK磷酸化誘導的細胞增殖,并影響細胞凋亡及周期,因此,EP4受體可能成為OSCC的治療靶點。
[Abstract]:Oral squamous cell carcinoma (Oral Squamous Cell Carcinoma, OSCC) is one of the common malignant tumor, its incidence shows a rising trend in the world. In the past 20 years, although the treatment method for the continuous development of OSCC, but the five year survival rate of OSCC without obvious improvement, so the pathogenesis. Study on the diagnosis and treatment of OSCC is still hot. In recent years, the research of inflammation and tumor in the tumor microenvironment has attracted much attention, especially cyclooxygenase (Cyclooxygenase, COX) pathway mediated role in the relationship between inflammation and cancer in the intermediate value to explore. The research results show that the overexpression of COX-2 and oral cancer development, invasion the related and drug resistance, and for non steroidal anti-inflammatory drugs (COX-2 Nonsteroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs) can inhibit the occurrence and development of malignant tumors, but its long-term use will have many Side effects such as gastric ulcer and myocardial infarction, clinical application of prostaglandin E2 (Prostaglandin E2 limited., PGE2) is the downstream products of the COX-2 pathway. The results show that PGE2 can promote the proliferation and invasion of malignant tumors, the possible mechanism is inhibiting the local immune response. However, PGE2 and its receptor subtype 4 (E-prostaglandin, EP4) influence on the biological characteristics of OSCC and the mechanism is not yet fully understood. Therefore, we passed in OSCC cells by exogenous addition of PGE2 antagonists and corresponding to the effects of PGE2 on proliferation and apoptosis of OSCC cells and to explore its possible mechanism, in order to find a potential target for the treatment of OSCC. (1) we use cellcounting kit 8 (CCK8) effect analysis of exogenous derived PGE2 on proliferation of Tca8113 OSCC cells, found in 48 h, PGE2 can significantly promote cell proliferation, the effect showed a dose dependent trend, and concentrated in PGE2 As the peak of 1 mol/L. (2) to Western-blot (WB) mechanism, study the method of PGE2 to promote the proliferation of Tca8113 cells we found that exogenous addition of PGE2 can activate the phosphorylation of ERK and phosphorylation by MEK inhibitor U0126 antagonized by CCK8; proliferation of Tca8113 cells was detected, we found that exogenous U0126 can promote the role of antagonist PGE2 on the proliferation of Tca8113 cells; the results show that PGE2 can be activated by phosphorylation of ERK promote the proliferation of Tca8113 cells. (3) WB assay showed that the 4 types of EP receptors were expressed in Tca8113 cells. (4) to determine the binding of EP and PGE2 receptor types, we added EP1, EP2 and EP4 receptor antagonist, the results show that the EP4 antagonist L-161982 can antagonize the effect of PGE2 on proliferation of Tca8113 cells, and showed a dose and time dependent; further with WB assay, we found that L-161982 PGE2 inhibition of ERK phosphorylation promotes, and thus play antagonism, it also proves that PGE2 is to promote cell proliferation by activating the phosphorylation of ERK. (5) in order to verify whether PGE 2 act by binding to the receptor EP4 in the cell, we added 3 types of EP receptor agonists the results, found that only EP4 agonist PGE1-OH can be recovered by celecoxib pretreatment of the proliferation of Tca8113 cells in a concentration dependent manner; further using WB method, we found that PGE1-OH through activation of ERK phosphorylation to promote cell proliferation, while MEK inhibitor U0126 inhibited this effect, suggesting that PGE2 might to promote cell proliferation by binding to a receptor of EP4. (6) flow cytometry showed that L-161982 could induce apoptosis of Tca8113 cells, and by blocking s can influence the cell cycle, and its effect is concentration dependent trend; WB method Found a step detection, L-161982 through upregulation of Bax and downregulation of Bcl-2 protein levels to induce cell apoptosis, and expression of cell cycle effects through upregulation of P21 and downregulation of CDK2 and CyclinA2 protein. In summary, this study found that PGE2 by combining the receptor EP4 mediated ERK phosphorylation induced cell proliferation, apoptosis and cell cycle and influence therefore, the EP4 receptor may become a therapeutic target for OSCC.

【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R739.8

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