本文選題：肺腺癌　切入點：組蛋白甲基轉移酶G9a　出處：《浙江大學》2017年碩士論文

【摘要】：背景和目的目前,肺癌是我國最常見且死亡率最高的惡性腫瘤之一,并且發(fā)病率仍呈上升趨勢。根據(jù)肺癌的病理特征,有非小細胞肺癌(NSCLC)和小細胞肺癌(SCLC)兩大類,目前NSCLC占確診肺癌病例的75%-80%;NSCLC又可細分為鱗癌、腺癌、腺鱗癌及大細胞癌等病理類型,其中肺腺癌約占NSCLC的50%。目前,肺癌已被廣泛認為是一種全身性的疾病,雖然手術治療在早中期肺腺癌治療方案選擇上處于不可撼動的地位,但是多學科的綜合治療越來越受重視。因此,深入研究肺腺癌的發(fā)病機理,篩選鑒定病理演進過程中的重要環(huán)節(jié)和關鍵分子,研發(fā)具有臨床治療價值的新型靶向藥物以改善患者的預后具有重要的科學和臨床價值。研究證實,表觀遺傳調控異常與原癌基因的激活、抑癌基因表達的缺失高度相關,且在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用,其中組蛋白甲基化修飾是細胞調控基因表達的重要途徑之一,參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。組蛋白甲基化是一個可逆的動態(tài)修飾過程,由特異的組蛋白甲基轉移酶和組蛋白去甲基酶協(xié)調完成。組蛋白甲基轉移酶G9a屬于SET域家族,催化組蛋白H3K9的單甲基化和二甲基化,其在肝癌、結腸癌、前列腺癌等多種腫瘤中有異常表達現(xiàn)象,可使腫瘤發(fā)生惡性進展導致預后不良。本研究擬通過體外實驗,以人肺腺癌細胞作為疾病模型,利用小分子靶向抑制劑BIX-01294干擾G9a的甲基轉移酶活性,觀察腫瘤細胞生長、增殖的變化和凋亡情況,同時檢測凋亡信號通路蛋白表達水平的變化,G9a催化產物H3K9me、H3K9me2的表達水平;應用pan Caspases抑制劑Z-VAD-FMK預處理細胞,研究BIX-01294靶向抑制G9a誘導肺腺癌細胞凋亡是否是Caspase途徑依賴性的;深入探討B(tài)IX-01294抑制人肺腺癌細胞增殖的作用效應及分子機制。方法培養(yǎng)人肺腺癌細胞A549、H1650和H1975,MTT實驗分析BIX-01294作用細胞24h對其生長的影響,BIX-01294作用7d,集落形成實驗分析A549、H1650和H1975細胞的增殖能力;BIX-01294作用24h,Annexin V-FITC/PI雙染法分析A549和H1975細胞凋亡率的變化;BIX-01294作用24h,Western blot實驗檢測G9a催化產物H3K9me、H3K9me2和細胞凋亡相關蛋白表達的水平;進一步應用pan Caspase抑制劑Z-VAD-FMK預處理A549細胞2h,抑制內源性Caspase的活性,研究Caspase級聯(lián)反應在BIX-01294誘導A549細胞凋亡、及凋亡相關蛋白表達中的作用。結果BIX-01294呈劑量依賴關系抑制肺腺癌細胞A549、H1650和H1975的增殖,不同濃度BIX-01294(1、2.5、5和10μM)作用24h,A549細胞的存活率分別為106.3%±7.2%、81.1%±4.8%、52.9%±5.6%和 19.8%±3.6%;H1650 細胞的存活率分別為 91.2%±4.4%、78.2%±5.1%、41.6%±4.8%和 16.8%±3.5%;H1975 細胞的存活率分別為 102.4%±6.3%、73.3%±4.3%、36.4%±2.8%和 12.5%±2.4%。集落形成實驗發(fā)現(xiàn),BIX-01294(10μM)作用A549細胞7d,空白對照組的集落形成數(shù)為172.7±23.0,BIX-01294組為42.5±8.7,顯著抑制A549細胞集落克隆的形成(p0.05);BIX-01294(10μM)作用H1975細胞7d,空白對照組的集落形成數(shù)為205.1±42.8,BIX-01294組為35.7±6.5,顯著抑制肺腺癌細胞H1975集落克隆的形成(p0.05)。Annexin V-FITC/PI 雙染實驗結果顯示,BIX-01294(10μM)作用24h,A549細胞的凋亡率由7.2%±3.6%上升至47.6%±8.4%,兩組間差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);H1975細胞的凋亡率由8.9%±5.2%上升至62.8%±8.2%,兩組間差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。BIX-01294作用24h,A549和H1975細胞中G9a催化產物H3K9me、H3K9me2的表達均顯著下降;線粒體凋亡途徑蛋白Bax、Bak和cleaved caspase9表達上調,抗凋亡蛋白Bcl-2表達下降,凋亡執(zhí)行蛋白cleaved caspase3和cleaved PARP表達顯著上調。pan Caspase抑制劑Z-VAD-FMK預處理A549細胞,顯著抑制BIX-01294誘導的細胞凋亡和cleaved caspase3和cleaved PARP蛋白的表達。結論小分子化合物BIX-01294靶向抑制組蛋白甲基轉移酶G9a具有抑制肺腺癌細胞增殖的作用效應,其分子機制是上調促凋亡蛋白Bax和Bak的表達,凋亡抑制蛋白Bcl-2表達下降,激活線粒體凋亡途徑,進而啟動Caspase級聯(lián)反應,誘導肺腺癌細胞的凋亡。
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【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R734.2
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本文編號：1674798