本文選題：腫瘤干細(xì)胞　切入點(diǎn)：結(jié)直腸癌　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：背景:結(jié)直腸癌是最常見(jiàn)的消化道腫瘤之一。在我國(guó),隨著生活方式、飲食結(jié)構(gòu)改變、人口老齡化等諸多因素影響,結(jié)直腸癌發(fā)病率近年來(lái)呈明顯的上升趨勢(shì),防治形勢(shì)仍十分嚴(yán)峻。而腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是其死亡的主要原因。腫瘤干細(xì)胞因其自我更新、無(wú)限增殖潛能、獨(dú)特的耐藥機(jī)制等特性被認(rèn)為是腫瘤產(chǎn)生和發(fā)展的元兇。而上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是腫瘤向外侵襲和轉(zhuǎn)移的重要方式。近幾年研究發(fā)現(xiàn),腫瘤干細(xì)胞與EMT關(guān)系密切。在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?EMT使腫瘤細(xì)胞獲得侵襲和轉(zhuǎn)移表型、耐受藥物攻擊并具有腫瘤干細(xì)胞表型。發(fā)生EMT的細(xì)胞上皮相關(guān)蛋白如E-鈣黏蛋白降低,而間質(zhì)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Snail、Twist及相關(guān)蛋白波形蛋白、纖連蛋白等則升高。腫瘤細(xì)胞通過(guò)EMT,其黏附力減弱,運(yùn)動(dòng)性增強(qiáng),可向遠(yuǎn)端侵襲及轉(zhuǎn)移。通過(guò)藥物誘導(dǎo)或高表達(dá)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子可使細(xì)胞發(fā)生EMT改變,而這些細(xì)胞可表現(xiàn)出腫瘤干細(xì)胞的特點(diǎn);另一方面,富集的腫瘤干細(xì)胞具備EMT細(xì)胞的表型和特點(diǎn)。因此,EMT被認(rèn)為是腫瘤干細(xì)胞的特性之一,通過(guò)EMT腫瘤干細(xì)胞可實(shí)現(xiàn)侵襲和轉(zhuǎn)移。然而,由于EMT是一個(gè)快速的轉(zhuǎn)化過(guò)程,目前所觀察到的結(jié)果多是從體外實(shí)驗(yàn)或動(dòng)物模型中獲得,真實(shí)腫瘤中發(fā)生的EMT及其在腫瘤中的作用仍有待證實(shí)。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展除了細(xì)胞具備自身增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移所需要的特性外,還必須能躲避機(jī)體的免疫監(jiān)視機(jī)制才能最終生存,而目前關(guān)于腫瘤干細(xì)胞的免疫逃逸機(jī)制尚不清楚。有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤免疫逃逸與EMT有關(guān),通過(guò)誘導(dǎo)EMT而形成的腫瘤中伴隨大量調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的浸潤(rùn)和樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)的功能受損。綜上分析,推測(cè)腫瘤免疫逃逸對(duì)于發(fā)生EMT侵襲、轉(zhuǎn)移的腫瘤干細(xì)胞躲避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視、清除并最終形成腫瘤具有重要的意義。B7H1是重要的起負(fù)向調(diào)控作用的共刺激因子,是程序性死亡受體PD-1的配體。腫瘤細(xì)胞高表達(dá)的B7H1可與淋巴細(xì)胞上PD-1結(jié)合而使淋巴細(xì)胞失能,從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。然而,B7H1在結(jié)直腸癌干細(xì)胞中的表達(dá)及其與EMT的關(guān)系并不清楚。因此,在本課題中,擬通過(guò)CD133分子對(duì)結(jié)直腸癌干細(xì)胞進(jìn)行分選鑒定,并對(duì)其在腫瘤組織中的分布特點(diǎn)及其EMT表型與B7H1的表達(dá)特點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè),了解腫瘤干細(xì)胞免疫逃逸的可能機(jī)制及其與emt的關(guān)系。此外,通過(guò)ifn-γ上調(diào)b7h1表達(dá)進(jìn)一步檢測(cè)b7h1表達(dá)變化對(duì)不同腫瘤細(xì)胞亞群干細(xì)胞相關(guān)表型和功能的影響。方法:(1)在結(jié)腸癌細(xì)胞株ht29中以cd133分子為標(biāo)記,通過(guò)磁珠分選得到不同的cd133+、cd133-細(xì)胞亞群,比較兩群細(xì)胞在nod/scid小鼠中的成瘤能力、無(wú)血清培養(yǎng)基中的成球能力有無(wú)差別。此外,通過(guò)q-pcr的方法檢測(cè)兩群細(xì)胞其他干性相關(guān)分子oct-4、sox-2的表達(dá)情況,并檢測(cè)emt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子twist、snail及相關(guān)蛋白e-鈣黏蛋白、波形蛋白、纖連蛋白的表達(dá)情況,以檢測(cè)分選到的cd133+細(xì)胞是否同時(shí)高表達(dá)其他干性分子并具有emt的表達(dá)特點(diǎn)。(2)收集結(jié)直腸癌手術(shù)標(biāo)本,制備冰凍切片。通過(guò)免疫熒光染色檢測(cè)結(jié)直腸癌組織中cd133在各期腫瘤中的分布情況,epcam分子用于區(qū)分腫瘤細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞。此外,通過(guò)cd133分子與e-鈣黏蛋白、波形蛋白在同一切片中染色,并用激光共聚焦顯微鏡同時(shí)觀察幾個(gè)分子的表達(dá)情況,以檢測(cè)cd133+細(xì)胞的emt表型。(3)通過(guò)免疫熒光染色檢測(cè)ht29細(xì)胞及結(jié)直腸癌組織中b7h1與cd133的表達(dá)情況,分析b7h1在各期腫瘤中的表達(dá)特點(diǎn)。此外,檢測(cè)b7h1陽(yáng)性細(xì)胞中e-鈣黏蛋白、波形蛋白的表達(dá)情況。(4)通過(guò)在培養(yǎng)體系中加入ifn-γ上調(diào)b7h1表達(dá),檢測(cè)ht29細(xì)胞cd133表達(dá)及emt表型的變化,并檢測(cè)不同cd133+、cd133-細(xì)胞亞群成瘤能力的改變,分析細(xì)胞因子作用上調(diào)b7h1表達(dá)后對(duì)腫瘤干樣細(xì)胞干性表型及功能的影響。研究結(jié)果:(1)通過(guò)優(yōu)化的磁珠分選方法,分選得到相應(yīng)的cd133+、cd133-細(xì)胞亞群,細(xì)胞純度在80%以上。cd133+細(xì)胞與cd133-細(xì)胞相比,在nod/scid小鼠體內(nèi)成瘤能力、無(wú)血清培養(yǎng)基中成球能力均顯著增強(qiáng),且高表達(dá)干性因子oct-4及sox-2,高表達(dá)emt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子snail、twist,間質(zhì)細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志波形蛋白、纖連蛋白,而低表達(dá)上皮細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志e-鈣黏蛋白。分選得到的cd133+ht29細(xì)胞具有干細(xì)胞相關(guān)的表型和特點(diǎn),并且相關(guān)基因的表達(dá)符合emt相關(guān)改變。(2)在結(jié)直腸癌組織中,伴隨組織tnm分期的增加,cd133總體表達(dá)水平呈上升趨勢(shì)。cd133表達(dá)于epcam+的腫瘤細(xì)胞上;此外,部分cd133+腫瘤細(xì)胞e-鈣黏蛋白表達(dá)降低而出現(xiàn)波形蛋白表達(dá),呈現(xiàn)emt的表型改變。(3)在ht29細(xì)胞及結(jié)直腸癌組織中,b7h1與cd133分子存在共表達(dá)的情況。B7H1分子在腫瘤組織中的表達(dá)比較復(fù)雜,收集的20例組織中,其中13例主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞上,該部分組織中B7H1與CD133的共表達(dá)現(xiàn)象普遍,且部分B7H1+細(xì)胞具有EMT的表型特點(diǎn)。而有6例組織中B7H1主要在間質(zhì)細(xì)胞上表達(dá),其中部分為CD3+T細(xì)胞。(4)IFN-γ作用后HT29細(xì)胞B7H1表達(dá)增加,細(xì)胞呈現(xiàn)梭形的EMT特征,但CD133表達(dá)陽(yáng)性率下降。進(jìn)一步用IFN-γ作用于不同的CD133+及CD133-細(xì)胞亞群,發(fā)現(xiàn)處理后CD133+細(xì)胞的成瘤能力沒(méi)有降低,但CD133-細(xì)胞亞群的成瘤能力則顯著增高。通過(guò)檢測(cè)IFNg R1、IFNg R2,發(fā)現(xiàn)IFN-γ作用后其受體mRNA水平在兩亞群細(xì)胞中均增高,其中IFNg R1的增高有顯著差異。此外,PCNA在作用后兩群細(xì)胞中增高明顯,提示了IFN-γ作用后可能增強(qiáng)了CD133-細(xì)胞亞群的增殖能力,使其在小鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)速度較快。結(jié)論:(1)以CD133為標(biāo)志分選到腫瘤細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞的特點(diǎn)。(2)CD133在結(jié)直腸癌中的表達(dá)與腫瘤TNM分期有關(guān),部分CD133+細(xì)胞具有EMT表型特點(diǎn)。(3)B7H1與CD133存在共表達(dá)情況且部分B7H1+細(xì)胞具有EMT表型特點(diǎn),推測(cè)上調(diào)B7H1可能是腫瘤干細(xì)胞免疫逃逸的機(jī)制之一。(4)IFN-γ作用后腫瘤細(xì)胞B7H1上調(diào)表達(dá)并發(fā)生EMT形態(tài)改變而CD133表達(dá)則下降。IFN-γ短期處理后沒(méi)有降低CD133+細(xì)胞的成瘤能力,但CD133-細(xì)胞成瘤能力明顯增強(qiáng),提示細(xì)胞因子作用可以改變不同亞群細(xì)胞的干性表型及功能,并有可能使非腫瘤干細(xì)胞向干細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.34

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1675033