本文選題：胃癌　切入點：microRNA-425-5p　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：1993年,Victor Ambros和Gary Ruvkun的研究團隊幾乎同時發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)了一類新的小分子RNA——即微小RNA(micro RNA;mi RNA),開啟了微小RNA研究紀(jì)元。微小RNA是由大約22至24個核苷酸組成的,在進化上十分保守的短鏈非編碼RNA,通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的方式實現(xiàn)其調(diào)節(jié)基因表達的功能。目前認(rèn)為微小RNA受到細(xì)胞類型和分化階段的嚴(yán)格調(diào)控,并在特定的組織和特定的階段表達。微小RNA表達的組織特異性和時序性顯示了它們對組織和細(xì)胞功能特異性的決定作用及在細(xì)胞生長和發(fā)育過程中多種重要調(diào)節(jié)作用。既往研究發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)腫瘤都存在micro RNA表達失調(diào),這些異常表達的micro RNA可參與腫瘤的發(fā)生、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等多個階段/多個方面。許多micro RNA已被確定作為癌基因、腫瘤抑制基因和細(xì)胞信號通路中的重要調(diào)節(jié)因子。micro RNA的致癌或腫瘤抑制功能依賴于其靶基因的作用。癌基因作用的micro RNA活性增加導(dǎo)致腫瘤抑制基因活性受抑制,同時促進細(xì)胞增殖以及腫瘤進展。腫瘤抑制基因作用的micro RNA的活性下降導(dǎo)致癌基因翻譯增加,促進腫瘤的形成。在全世界范圍內(nèi),胃癌在亞洲高發(fā),而歐美發(fā)達國家發(fā)病率相對較低。胃癌在腫瘤中排名第四,并是第二大致死性腫瘤疾病。每年約有100萬的胃癌新增病例。胃癌的發(fā)病是一個受遺傳、環(huán)境、飲食、生活習(xí)慣等多因素的影響的復(fù)雜過程,其確切機制仍需要更加深入的探索。微小RNA發(fā)現(xiàn)及相關(guān)研究的進展,使我們探討胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程多了一條新的途徑。多個微小RNA(mi RNA;mi R),如mi R-9、mi R-421、mi R-27a、mi R-143、mi R-145、mi R-29及mi R-101等,已被證實在胃癌中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。并可通過調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移能力的改變而參與胃癌的發(fā)生發(fā)展,其表達水平變化的聯(lián)合檢測,有望成為胃癌早期診斷、預(yù)后評估的重要標(biāo)記分子,并可能成為胃癌治療的新靶點。在細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等方面,多個mi RNAs在胃癌中在多個方面產(chǎn)生作用。例如,mi R-199a可以影響胃癌細(xì)胞的增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移功能,mi R-301a和mi R-1303均能在細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移四個方面調(diào)節(jié)胃癌的發(fā)生和發(fā)展。Ueda等通過較大樣本臨床標(biāo)本通過芯片篩選后發(fā)現(xiàn),在胃癌組織中micro RNA-425-5p表達水平顯著高于癌旁正常胃粘膜組織。作為最為常見惡性腫瘤之一的胃癌,micro RNA-425-5p在既往研究中表達失調(diào),存在參與胃癌發(fā)生、發(fā)展的可能性。目前在腫瘤、尤其是胃癌中還未見micro RNA-425-5p相關(guān)研究。本研究目的在于探討micro RNA-425-5p在胃癌細(xì)胞中的表達改變及其對胃癌發(fā)生發(fā)展的影響,以期為胃癌的發(fā)病機制研究開辟新的領(lǐng)域,為micro RNA-425-5p在胃癌的早期診斷以及預(yù)后評估和治療等方面實踐和應(yīng)用,提供理論依據(jù)。本系列研究基于以上問題,在胃癌方面進行下列研究:應(yīng)用Taqman探針法對胃癌上皮細(xì)胞株SGC-7901、MKN-28、MKN-45、BGC-823、AGS,和胃粘膜正常細(xì)胞株GES-1中的micro RNA-425-5p表達水平進行檢測,評估m(xù)icro RNA-425-5p的表達差異是否存在顯著性。如果胃癌上皮細(xì)胞株和GES-1存在micro RNA-425-5p的表達顯著性差異,則選取特定胃癌上皮細(xì)胞株作為進一步研究對象。在細(xì)胞水平,通過上調(diào)和下調(diào)micro RNA-425-5p表達水平觀察其對胃癌細(xì)胞在增殖、細(xì)胞周期、侵襲、轉(zhuǎn)移等方面的影響。而后在細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)上,建立移植瘤動物模型,進一步在體內(nèi)證實其作用機制。初步揭示micro RNA-425-5p的異常表達與胃癌的發(fā)生、發(fā)展存在的關(guān)聯(lián),以及在臨床應(yīng)用中的潛在價值。本課題三部分的具體內(nèi)容如下:第一部分micro RNA-425-5p在胃癌細(xì)胞中的表達目的:選取胃癌上皮細(xì)胞株:SGC-7901、MKN-28、MKN-45、BGC-823、AGS和胃粘膜正常細(xì)胞株GES-1,評估m(xù)icro RNA-425-5p在胃癌上皮細(xì)胞株與GES-1中的表達差異。方法:培養(yǎng)至最佳狀態(tài)的胃癌上皮細(xì)胞株:SGC-7901、MKN-28、MKN-45、BGC-823、AGS和胃粘膜正常細(xì)胞株GES-1的總RNA應(yīng)用TRIzol#174;試劑提取。應(yīng)用Taq Man Micro RNA Assay和Taq Man Universal PCR Master Mix,對細(xì)胞的micro RNA-425-5p表達水平進行q RT-PCR檢測,比較micro RNA-425-5p在不同細(xì)胞株中的表達差異。結(jié)果:胃癌上皮細(xì)胞株micro RNA-425-5p較正常胃粘膜細(xì)胞GES-1的micro RNA-425-5p表達水平明顯升高,其中以MKN-45、SGC-7901、BGC-823升高最為顯著。小結(jié):與正常胃粘膜上皮細(xì)胞株GES-1比較,胃癌上皮細(xì)胞株(SGC-7901、MKN-28、MKN-45、BGC-823、AGS)micro RNA-425-5p的表達水平顯著升高。其中以MKN-45、SGC-7901、BGC-823升高最為顯著。與既往研究臨床樣本的檢測結(jié)果一致。初步揭示了micro RNA-425-5p的異常表達與胃癌的發(fā)生、發(fā)展存在某種關(guān)聯(lián),值得進一步在細(xì)胞等水平進行進一步研究。第二部分micro RNA-425-5p對胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響目的:觀察micro RNA-425-5p表達水平變化對BGC-823細(xì)胞在增殖、細(xì)胞周期、侵襲、轉(zhuǎn)移等方面的影響。方法:通過應(yīng)用micro RNA-425-5p的模擬物和抑制劑對胃癌上皮細(xì)胞株BGC-823經(jīng)瞬時轉(zhuǎn)染后調(diào)高或調(diào)低micro RNA-425-5p在胃癌細(xì)胞中的表達水平。應(yīng)用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞增殖能力變化;軟瓊脂集落形成試驗評估細(xì)胞錨著非依賴性生長能力;通過細(xì)胞遷移和侵襲實驗評估細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力變化。結(jié)果:1與inhibitor NC組和BGC-823空白對照組(簡稱WT組)比較,轉(zhuǎn)染micro RNA-425-5p inhibitor的BGC-823細(xì)胞增殖率顯著下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;BGC-823細(xì)胞轉(zhuǎn)染micro RNA-425-5p mimics 24h后,細(xì)胞增殖率升高,與mimics NC組比較,細(xì)胞活力增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。同時由于micro RNA-425-5p表達的增加,細(xì)胞錨著非依賴性生長能力增強,高度提示micro RNA-425-5p可能對腫瘤生長起促進作用。2BGC-832細(xì)胞轉(zhuǎn)染micro RNA-425-5p inhibitor后,細(xì)胞遷移能力較inhibitor NC組和BGC-823空白對照組(簡稱WT組)顯著下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。而BGC-832細(xì)胞中轉(zhuǎn)染micro RNA-425-5p mimics后,細(xì)胞遷移能力顯著高于mimics NC組。實驗表明micro RNA-425-5p具有促進胃癌細(xì)胞遷移的能力。3細(xì)胞侵襲實驗發(fā)現(xiàn):micro RNA-425-5p inhibitor轉(zhuǎn)染BGC-832細(xì)胞后,細(xì)胞侵襲能力較inhibitor NC組和BGC-823空白對照組(簡稱WT組)顯著下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。micro RNA-425-5p mimics轉(zhuǎn)染BGC-832細(xì)胞后,細(xì)胞侵襲能力較mimics NC組顯著增強,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。實驗表明micro RNA-425-5p具有促進胃癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的能力。小結(jié):1胃癌上皮細(xì)胞株BGC-823體外轉(zhuǎn)染micro RNA-425-5p mimics可有效提高micro RNA-425-5p表達水平,與而mimics NC組相比,細(xì)胞增殖率升高;而BGC-823細(xì)胞轉(zhuǎn)染micro RNA-425-5p inhibitor后,micro RNA-425-5p表達水平降低,細(xì)胞增殖率顯著下降,提示micro RNA-425-5p可促進胃癌細(xì)胞增殖途徑參與胃癌的發(fā)生發(fā)展過程。2軟瓊脂集落形成實驗顯示,隨著micro RNA-425-5p表達的增加,細(xì)胞錨著非依賴性生長能力增強。高度提示micro RNA-425-5p對腫瘤生長起促進作用。3 BGC-823細(xì)胞轉(zhuǎn)染micro RNA-425-5p inhibitor,細(xì)胞遷移能力顯著下降。而BGC-823細(xì)胞中轉(zhuǎn)染micro RNA-425-5p mimics后,細(xì)胞遷移能力顯著增強。實驗表明micro RNA-425-5p具有較強的促進胃癌細(xì)胞遷移的能力。4經(jīng)細(xì)胞侵襲實驗發(fā)現(xiàn):micro RNA-425-5p inhibitor轉(zhuǎn)染BGC-823細(xì)胞后,細(xì)胞侵襲能力下降。而micro RNA-425-5p mimics轉(zhuǎn)染BGC-823細(xì)胞后,細(xì)胞侵襲能力顯著增強。提示micro RNA-425-5p促進胃癌細(xì)胞侵襲。第三部分micro RNA-425-5p對裸鼠肺轉(zhuǎn)移的影響目的:動物實驗-裸鼠成瘤實驗來進一步評估m(xù)icro RNA-425-5p對腫瘤侵襲/轉(zhuǎn)移的影響。方法:15~16g 4~5周齡雌性BALB/C裸鼠15只,隨機分為3組,每組5只。在無菌操作下,用0.1ml注射器接種0.1ml細(xì)胞懸液(約含1x106個/細(xì)胞)于裸鼠尾靜脈建立移植瘤模型。6周后引頸法處死裸鼠,解剖并取出裸鼠肺組織。經(jīng)HE染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察裸鼠肺轉(zhuǎn)移瘤情況,并以組為單位對肺轉(zhuǎn)移瘤計數(shù)。結(jié)果:與接種轉(zhuǎn)染micro RNA-425-5p inhibitor Negative control的BGC-823細(xì)胞組和BGC-823空白對照組(簡稱WT組)相比,接種轉(zhuǎn)染micro RNA-425-5p inhibitor的BGC-823細(xì)胞的裸鼠,肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)目顯著減少,提示lmicro RNA-425-5p inhibitor在腫瘤發(fā)展過程中發(fā)揮抑制腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的作用。與細(xì)胞學(xué)實驗結(jié)果吻合。小結(jié):裸鼠移植瘤模型實驗提示micro RNA-425-5pinhibitor在腫瘤發(fā)展過程中發(fā)揮抑制腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的作用。進而說明micro RNA-425-5p調(diào)高可以促進腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移;調(diào)低micro RNA-425-5p可以抑制腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移能力。結(jié)論1胃癌上皮細(xì)胞株(SGC-7901、MKN-28、MKN-45、BGC-823、AGS)micro RNA-425-5p較正常胃粘膜細(xì)胞GES-1的micro RNA-425-5p表達水平明顯升高,其中以MKN-45、SGC-7901、BGC-823升高最為顯著。2 micro RNA-425-5p的調(diào)高可以促進胃癌細(xì)胞株BGC-823增殖,而調(diào)低可以抑制BGC-823的增殖能力。3軟瓊脂集落形成實驗結(jié)果表明,micro RNA-425-5p表達的增加,細(xì)胞錨著非依賴性生長能力增強,提示micro RNA-425-5p可能對腫瘤生長起促進作用。4 BGC-823細(xì)胞轉(zhuǎn)染micro RNA-425-5p inhibitor后,細(xì)胞遷移能力顯著下降,而BGC-823細(xì)胞中轉(zhuǎn)染micro RNA-425-5p mimics后,細(xì)胞遷移能力顯著高于mimics NC組。實驗表明micro RNA-425-5p具有較強的促進胃癌細(xì)胞遷移的能力。5 micro RNA-425-5p inhibitor轉(zhuǎn)染BGC-823細(xì)胞后,細(xì)胞侵襲能力較inhibitor NC組和BGC-823空白對照組(簡稱WT組)顯著下降。micro RNA-425-5p mimics轉(zhuǎn)染BGC-823細(xì)胞后,細(xì)胞侵襲能力較mimics NC組顯著增強。表明micro RNA-425-5p促進胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。6與接種轉(zhuǎn)染micro RNA-425-5p inhibitor Negative control的BGC-823細(xì)胞組和BGC-823空白對照組(簡稱WT組)相比,接種轉(zhuǎn)染micro RNA-425-5p inhibitor的BGC-823細(xì)胞的裸鼠,肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)目顯著減少,提示micro RNA-425-5p inhibitor在腫瘤發(fā)展過程中發(fā)揮抑制腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的作用。進而說明micro RNA-425-5p調(diào)高可以促進腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移;調(diào)低micro RNA-425-5p可以抑制腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移能力。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.2

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本文編號：1657231