本文選題：miR-520d-5p　切入點(diǎn)：人胃癌細(xì)胞　出處：《廣東藥學(xué)院》2015年碩士論文

【摘要】：目的高通量篩選胃癌組織中異常表達(dá)的mi RNAs,選擇在胃癌組織中高表達(dá)的mi RNA-520d-5p,并探討其對(duì)人胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲方面的作用。方法從3對(duì)手術(shù)切除的胃癌組織和配對(duì)的癌旁正常胃組織中提取總RNA,mi RNA芯片分析法檢測(cè)mi RNA表達(dá)水平,然后在47例相互配對(duì)的胃癌和癌旁正常胃組織標(biāo)本中,用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time RT-PCR,Taqman法)對(duì)部分差異表達(dá)的mi RNA進(jìn)行驗(yàn)證。利用脂質(zhì)體在胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS和HGC-27中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染mi R-520d-5p inhibitor(mi R-520d-5p抑制劑)以降低mi R-520d-5p的表達(dá)水平,mi R-520d-5p inhibitor negative control(mi R-520d-5p抑制劑陰性對(duì)照)組做陰性對(duì)照組(簡(jiǎn)稱NC組)。轉(zhuǎn)染48h后,Real-time RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞系中mi R-520d-5p的表達(dá)水平。WST-1實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胃癌細(xì)胞的增殖能力,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期變化,細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力,transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力。結(jié)果1.mi RNA芯片分析結(jié)果顯示:與配對(duì)的正常胃組織相比,有62個(gè)mi RNAs在胃癌組織中異常表達(dá),其中42個(gè)mi RNA高表達(dá),20個(gè)mi RNA低表達(dá)。2.Real-time RT-PCR結(jié)果顯示:mi R-520d-5p在胃癌組織中表達(dá)顯著提高(P=0.032)。3.轉(zhuǎn)染mi R-520d-5p inhibitor后,Real-time RT-PCR檢測(cè)AGS和HGC-27中mi R-520d-5p表達(dá)水平,結(jié)果顯示:與陰性對(duì)照組比較,mi R-520d-5p的表達(dá)分別降低了62倍(P0.001)和88倍(P0.001)。以上結(jié)果表明:通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染mi R-520d-5p inhibitor可有效下調(diào)mi R-520d-5p在胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平。4.WST-1實(shí)驗(yàn)顯示在AGS和HGC-27細(xì)胞中降低mi R-520d-5p的表達(dá)96h后,與對(duì)照相比細(xì)胞生長(zhǎng)速度均明顯減慢,分別降低35.08%(F=51.496,P0.001;和21.03%F=56.689,P0.001)。細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示AGS/NC組克隆形成數(shù)為137.7+13.1個(gè),實(shí)驗(yàn)組AGS/mi R-520d-5p inhibitor克隆形成數(shù)為56.7+8.5個(gè),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.006,P=0.001);HGC-27NC組克隆形成數(shù)為111.7+10.0個(gè),實(shí)驗(yàn)組HGC-27/mi R-520d-5p inhibitor克隆形成數(shù)為58.3+5.5個(gè),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.081,P=0.001)。以上結(jié)果表明:降低mi R-520d-5p的表達(dá)水平能抑制胃癌細(xì)胞的增殖和克隆形成能力。5.流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期分布結(jié)果顯示,與NC組相比,降低mi R-520d-5p表達(dá)后,AGS和HGC-27細(xì)胞S期細(xì)胞數(shù)分別增加11.88%(T=-20.193,P0.001)和13.94%(T=-6.578,P=0.003)。6.Tranwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示:陰性對(duì)照組AGS/negative control穿膜細(xì)胞數(shù)為353.3±22.0個(gè),實(shí)驗(yàn)組AGS/mi R-520d-5p inhibitor穿膜細(xì)胞數(shù)為個(gè)148.0±8.5,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-15.051,p0.001);陰性對(duì)照組HGC-27/negative control穿膜細(xì)胞數(shù)為336.7±12.1個(gè),實(shí)驗(yàn)組HGC-27/mi R-520d-5p inhibitor穿膜細(xì)胞數(shù)為224.3±17.5個(gè),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-9.155,p=0.001)。以上結(jié)果表明:降低mi R-520d-5p表達(dá)水平可以抑制胃癌細(xì)胞的侵襲能力。7.Tranwell遷移實(shí)驗(yàn)顯示:AGS/NC組穿膜細(xì)胞數(shù)為382.0±12.1個(gè),AGS/mi R-520d-5p inhibitor組穿膜細(xì)胞數(shù)為個(gè)189.3±19.6,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-14.464,p0.001);HGC-27/NC組穿膜細(xì)胞數(shù)為400.0±19.1個(gè),HGC-27/mi R-520d-5p inhibitor組穿膜細(xì)胞數(shù)為215.3±16.6個(gè),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-12.660,p=0.001)。以上結(jié)果表明:降低mi R-520d-5p表達(dá)水平可以抑制胃癌細(xì)胞的遷移能力。8.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示:AGS和HGC-27劃痕24h后mi RNA-520d-5p抑制表達(dá)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞愈合率分別為12.24%±1.6%和9.74%±1.6%,與陰性對(duì)照組19.77%±1.4%和45.22%±4.0%比較,P0.05,實(shí)驗(yàn)具顯著性差異。AGS和HGC-27劃痕48h后mi RNA-520d-5p抑制表達(dá)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞愈合率分別為32.82%±1.2%和40.46%±1.2%,與陰性對(duì)照組42.79%±3.3%和67.58%±2.1%比較P0.05,實(shí)驗(yàn)具有顯著性差異。結(jié)論1.mi R-520d-5p在胃癌組織中表達(dá)水平顯著高于正常胃組織。2.降低胃癌細(xì)胞中mi R-520d-5p的表達(dá)水平,可以抑制胃癌細(xì)胞的增殖,遷移,侵襲能力,并在S期對(duì)細(xì)胞周期有阻滯作用。
[Abstract]:The purpose of high-throughput screening of abnormal expression of MI in gastric cancer RNAs, high expression of MI in gastric cancer RNA-520d-5p, and explore the proliferation of human gastric cancer cell migration and invasion method from 3 aspects of the role. The resected gastric cancer tissues and adjacent normal gastric tissue total RNA extraction, analysis mi RNA Mi chip to detect the expression level of RNA, and then pairing in 47 cases of gastric carcinoma and adjacent normal gastric tissues by real-time fluorescence quantitative PCR (Real-time RT-PCR Taqman) to verify the MI RNA part of differential expression. By liposome in AGS HGC-27 and R-520d-5p inhibitor in transiently transfected Mi gastric cancer cells the Department (MI R-520d-5p inhibitor) to reduce the expression level of MI R-520d-5p, MI R-520d-5p inhibitor negative control (MI inhibitor R-520d-5p negative control group) negative control group (NC group). After transfection of 48h, Real-tim E RT-PCR detection of transfected cell lines were mi R-520d-5p.WST-1 expression level and cell clone formation experiment of gastric cancer cell proliferation assay, cell cycles were determined by flow cytometry, cell migration scratch assay and Transwell migration assay and cell invasion assay, Transwell cells. The results of the analysis results of 1.mi RNA chip display: compared with normal gastric tissue matching, abnormal expression of 62 mi RNAs in gastric cancer, the high expression of MI 42 RNA, 20 mi RNA low expression of.2.Real-time RT-PCR showed that the expression of MI R-520d-5p in gastric cancer tissues increased significantly (P=0.032).3. mi R-520d-5p inhibitor after transfection, the level of MI, R-520d-5p the expression of Real-time RT-PCR and HGC-27 AGS detection results showed that: compared with the control group, the expression of MI R-520d-5p decreased 62 times (P0.001) and 88 times (P0.0 01). The above results show that the transient transfection of MI R-520d-5p inhibitor showed effective down-regulation of MI R-520d-5p in gastric cancer cell lines in the expression level of.4.WST-1 decreased expression of 96h mi R-520d-5p experiment in AGS and HGC-27 cells, compared with the control cell growth speed was significantly slowed down and reduced 35.08% respectively (F=51.496, P0.001; and 21.03%F=56.689, P0.001). Cell clone formation assay showed that the AGS/NC group the number of colonies formed into 137.7+13.1, experimental group AGS/mi R-520d-5p inhibitor clone number is 56.7+8.5, the difference was statistically significant (t= 9.006, P=0.001); group HGC-27NC clone number is 111.7+10.0, R-520d-5p inhibitor HGC-27/mi in the experimental group the number of colonies formed into 58.3+5.5. The difference was statistically significant (t=8.081, P=0.001). The above results show that reduced proliferation and cloning expression of MI R-520d-5p can inhibit the formation of gastric cancer cells Analysis of cell cycle distribution results showed that the ability of.5. flow cytometry, compared with NC group, MI decreased the expression of R-520d-5p, AGS and HGC-27 cells in S phase cells were increased by 11.88% (T=-20.193, P0.001) and 13.94% (T=-6.578, P=0.003).6.Tranwell invasion assay showed: negative control group AGS/negative control transmembrane cell number was 353.3. 22, the experimental group AGS/mi R-520d-5p inhibitor transmembrane cell number was 148 + 8.5, the difference was statistically significant (t=-15.051, p0.001); negative control group HGC-27/negative control transmembrane cell number was 336.7 + 12.1, the experimental group HGC-27/mi R-520d-5p inhibitor transmembrane cell number was 224.3 + 17.5, the difference was statistically significant (t=-9.155, p=0.001). The above results show that MI reduced the expression level of R-520d-5p can inhibit the invasive ability of gastric cancer cells.7.Tranwell migration assay showed that: AGS/NC cells was 382 + 12.1 AGS/mi, R-520d-5p inhibitor cells was 189.3 + 19.6, the difference was statistically significant (t=-14.464, p0.001); HGC-27/NC cells was 400 + 19.1, HGC-27/mi R-520d-5p inhibitor cells was 215.3 + 16.6, the difference was statistically significant (t=-12.660, p=0.001). The above results showed that the migration ability of.8. cells to reduce the expression level of R-520d-5p Mi scratch test can inhibit gastric cancer cells: expression of cells in the experimental group the healing rate were 12.24% + 1.6% and 9.74% + 1.6% mi RNA-520d-5p AGS and HGC-27 24h after inhibition of scratch, the control group of 19.77% + 1.4% and 45.22% + 4%, and P0.05 negative and significant experiment the difference between.AGS and HGC-27 after 48h mi RNA-520d-5p inhibits the expression of wound healing rate of cells in the experimental group were 32.82% + 1.2% and 40.46% + 1.2%, 42.79% + 3.3% and 67.58% + group 2.1% P0.05 compared with the negative control, experiment Conclusion the expression level of 1.mi R-520d-5p in gastric cancer tissue is significantly higher than that in normal gastric tissue.2., and the expression level of MI R-520d-5p in gastric cancer cells can inhibit the proliferation, migration and invasion ability of gastric cancer cells, and block cell cycle in S stage.

【學(xué)位授予單位】：廣東藥學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.2

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本文編號(hào)：1657226