本文選題：HCV　切入點(diǎn)：HCC　出處：《河南大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：背景新型免疫調(diào)控因子TIPE2(Tumor necrosis factor alpha-induced protein 8-like 2)是一種在炎癥反應(yīng)及免疫自穩(wěn)過(guò)程中不可或缺的負(fù)性調(diào)控因子。先前發(fā)現(xiàn)TIPE2在小鼠體內(nèi)的下調(diào)通常會(huì)導(dǎo)致致命性炎癥。隨著研究的進(jìn)一步深入,有報(bào)道稱TIPE2在人體內(nèi)往往和自身免疫性疾病相關(guān),主要表達(dá)于免疫組織和細(xì)胞中;在一些非免疫組織及細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)有表達(dá),包括肝細(xì)胞,神經(jīng)細(xì)胞,以及宮頸、胃腸道的上皮細(xì)胞等,提示在人體的非免疫器官及細(xì)胞中,TIPE2也可能具有一定的調(diào)節(jié)作用。目的闡明TIPE2在HCV感染后誘導(dǎo)腫瘤形成過(guò)程中所起的作用及分子機(jī)制。方法1.TIPE2與肝癌關(guān)系的確認(rèn)1.1收集HCV陽(yáng)性肝癌病人標(biāo)本,包括癌組織及癌旁組織,利用Western blot比較TIPE2的表達(dá)差異。1.2以肝癌細(xì)胞系Huh7及正常肝細(xì)胞系Changliver為研究對(duì)象,分別建立TIPE2過(guò)表達(dá)及TIPE2沉默穩(wěn)定株,繼而進(jìn)行生長(zhǎng)曲線描繪、克隆形成實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)等檢測(cè)TIPE2對(duì)肝癌細(xì)胞、正常肝細(xì)胞的增殖、克隆形成能力及劃痕愈合能力等的影響。1.3將上述建好的穩(wěn)定株對(duì)裸鼠進(jìn)行腋下注射,觀察裸鼠成瘤情況。2.探討HCV對(duì)TIPE2的調(diào)節(jié)作用2.1在293T細(xì)胞中將TIPE2分別與HCV編碼蛋白(包括NS3/4A、NS5A、NS5B等)共轉(zhuǎn)染,48h后Western blot檢測(cè)哪個(gè)(些)編碼蛋白對(duì)TIPE2的表達(dá)有影響。2.2在293T細(xì)胞中,將上述對(duì)TIPE2表達(dá)有影響的HCV編碼蛋白與TIPE2共轉(zhuǎn)染,利用免疫共沉淀和免疫熒光-激光共聚焦檢測(cè)TIPE2與這些蛋白的相互作用情況。進(jìn)一步在Huh7細(xì)胞中進(jìn)行驗(yàn)證。3.檢測(cè)TIPE2對(duì)DNA損傷通路的影響3.1將1中裸鼠的瘤組織進(jìn)行組織切片,檢測(cè)DNA損傷情況。3.2利用DNA損傷藥物HU處理TIPE2過(guò)表達(dá)及TIPE2沉默穩(wěn)定株,然后Western blot檢測(cè)過(guò)表達(dá)、沉默TIPE2對(duì)DNA損傷/修復(fù)通路中關(guān)鍵蛋白H2AX、Chk1、Chk2等的磷酸化水平是否有影響。結(jié)果1.HCV陽(yáng)性肝癌病人肝組織中TIPE2表達(dá)下調(diào)。2.HCV編碼蛋白NS5A可以促使TIPE2降解。3.HCV編碼蛋白NS5A與TIPE2可以相互作用,且在胞漿共定位。4.過(guò)表達(dá)TIPE2后,DNA損傷/修復(fù)通路中的關(guān)鍵分子γ-H2AX、p Chk1與p Chk2表達(dá)明顯下降;沉默TIPE2后,γ-H2AX、p Chk1與p Chk2表達(dá)明顯上升。5.過(guò)表達(dá)TIPE2后,細(xì)胞增殖速度、克隆形成能力及劃痕愈合能力顯著減弱。沉默TIPE2后,細(xì)胞增殖速度、克隆形成能力及劃痕愈合能力顯著增強(qiáng)。6.裸鼠皮下注射TIPE2過(guò)表達(dá)及對(duì)照組穩(wěn)定株細(xì)胞后,過(guò)表達(dá)組的成瘤能力明顯不及對(duì)照組;注射TIPE2沉默及對(duì)照組穩(wěn)定株細(xì)胞后,沉默組的成瘤能力高于對(duì)照組。7.檢測(cè)上述瘤組織中的DNA損傷情況,發(fā)現(xiàn)TIPE2過(guò)表達(dá)組未出現(xiàn)陽(yáng)性著色顆粒,幾乎不存在DNA損傷,而其相應(yīng)的對(duì)照組中則出現(xiàn)大量陽(yáng)性顆粒,DNA損傷嚴(yán)重;相反,在TIPE2沉默組其陽(yáng)性著色顆粒明顯多于對(duì)照組,DNA損傷情況較對(duì)照組更為嚴(yán)重。結(jié)論依據(jù)上述結(jié)果可以得知:TIPE2可以通過(guò)調(diào)控DNA損傷/修復(fù)通路參與HCV感染后誘導(dǎo)腫瘤形成的過(guò)程,研究結(jié)果為深入揭示HCV致癌機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù),為尋找新的抗腫瘤藥物提供理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R730.2

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本文編號(hào)：1656759