本文選題：Notch-1　切入點：NF-κB　出處：《電子科技大學》2016年博士論文

【摘要】：癌癥是威脅人類生命最嚴重的疾病之一,據(jù)美國癌癥協(xié)會2015年最新的年度統(tǒng)計數(shù)據(jù)報告顯示肺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌和乳腺癌仍然是癌癥死亡的最常見原因。世界癌癥報告估計2012年我國癌癥發(fā)病人數(shù)約360萬,癌癥死亡人數(shù)約為220萬,約占全球癌癥死亡人數(shù)的四分之一,而90%的腫瘤病人死于癌癥的轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移是腫瘤惡性行為的特征性表現(xiàn),也是臨床治療失敗的主要原因,控制轉(zhuǎn)移成功與否是決定癌癥患者生存與否的關(guān)鍵。但腫瘤是多基因控制的復雜疾病,深入研究癌癥發(fā)生與轉(zhuǎn)移的分子機制,對未來的靶向治療癌癥具有非常重要的作用。Notch信號通路高度保守,最先發(fā)現(xiàn)是在胚胎發(fā)育和細胞分化方面起作用,隨后的大量研究發(fā)現(xiàn)異�；罨腘otch信號通路與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。Notch-1及其配體的過表達與乳腺癌的預后率密切相關(guān)。然而,Notch-1信號通路在乳腺癌中的作用機制并不清楚。本研究以高轉(zhuǎn)移性乳腺癌細胞系MDA-MB-231為研究對象,首先分析Notch家族受體Notch-1對乳腺癌細胞惡性行為的作用,證實了Notch-1活化促進乳腺癌細胞的生長、黏附、遷移和侵襲等惡性行為。然后闡明了Notch-1促進細胞遷移的機制。研究內(nèi)容如下:1.細胞模型的構(gòu)建:通過反轉(zhuǎn)錄PCR從人腦膠質(zhì)瘤細胞系U251細胞中獲取人Notch-1胞內(nèi)段(NICD)的序列全長cDNA,并克隆到載體pcDNA3.1(+)中。通過瞬時轉(zhuǎn)染進MDA-MB-231細胞中,經(jīng)Real-time PCR和Western blot鑒定轉(zhuǎn)染后細胞中NICD成功過表達。Notch-1 shRNA經(jīng)瞬時轉(zhuǎn)染后也有效降低Notch-1的表達。2.Notch-1對乳腺癌細胞惡性行為的作用:(1)通過CCK-8、平板克隆以及軟瓊脂糖克隆形成實驗分析細胞增殖能力證明過表達NICD能夠促進細胞增殖,而沉默Notch-1則會抑制細胞增殖。(2)通過流式細胞術(shù)和Calcein AM/PI雙染發(fā)現(xiàn)NICD過表達促進細胞周期大量進入S期并抑制細胞凋亡,沉默Notch-1則將細胞周期阻滯才G0/G1期且促進細胞凋亡。(3)通過細胞黏附分析實驗、劃痕實驗以及Transwell小室實驗證實NICD過表達促進細胞的黏附、遷移和侵襲。相反,沉默Notch-1則抑制細胞的黏附、遷移和侵襲能力。以上實驗表明Notch-1活化對細胞的惡性行為有促進作用。3.Notch-1促進MMP-2、MMP-9、VEGF的表達:Real-time PCR和明膠酶譜實驗證實Notch-1活化促進MMP-2、MMP-9和VEGF的表達,并增強MMP-9的活性。沉默Notch-1則抑制MMP-2、MMP-9和VEGF的表達,且MMP-9的活性也隨之降低。4.Notch-1活化NF-κB信號通路:(1)通過免疫熒光、western blot、EMSA、雙熒光素酶報告基因檢測證明Notch-1活化導致IκBα降解,促進NF-κB的p65亞基入核轉(zhuǎn)移,并增強NF-κB與DNA的結(jié)合活性和轉(zhuǎn)錄活性。沉默Notch-1抑制IκBα降解,導致p65入核轉(zhuǎn)移減少,NF-κB的DNA結(jié)合活性和轉(zhuǎn)錄活性都降低。(2)Western blot分析證明Notch-1活化促進NF-κB下游靶基因Cyclin D1、Bcl-xL、Survivin的表達。說明Notch-1活化能夠激活NF-κB信號通路。5.Notch-1促進細胞侵襲依賴于NF-κB的活性:(1)LPS刺激促進細胞侵襲,并拮抗Notch-1沉默導致的細胞侵襲能力降低。NF-κB抑制劑處理抑制細胞的侵襲能力,并阻斷NICD過表達引起的細胞侵襲能力增強。(2)抑制Notch-1活性,LPS處理仍能夠增加MMP-2、MMP-9和VEGF的表達。而抑制NF-κB,活化的Notch-1不能促進MMP-2、MMP-9和VEGF的表達。以上結(jié)果說明Notch-1促進細胞侵襲必須依賴于NF-κB活性。6.Notch-1活化NF-κB的機制:(1)Western blot分析證明Notch-1活化激活PI3K/AKT信號通路,而抑制PI3K磷酸化則Notch-1活化不能增強AKT的磷酸化水平。(2)Western blot和免疫熒光技術(shù)證明抑制AKT磷酸化,Notch-1活化不能誘導p65入核轉(zhuǎn)移。說明Notch-1通過PI3K/AKT途徑活化NF-κB。(3)活化Notch-1增強PP2A的磷酸化水平,抑制其活性。PP2A抑制劑OA(岡田酸)抑制PP2A活性后Notch-1沉默不能降低PI3K、AKT的磷酸化水平。免疫熒光染色和western blot分析證實OA抑制PP2A活性后沉默Notch-1不能減少p65入核轉(zhuǎn)移。雙熒光素酶報告基因檢測也證實了OA抑制PP2A活性增強NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性,且逆轉(zhuǎn)Notch-1沉默引起的NF-κB轉(zhuǎn)錄活性降低。說明Notch-1通過PP2A調(diào)控了NF-κB的活性。綜上所述,本論文通過分析Notch-1在乳腺癌生長和轉(zhuǎn)移方面的作用,明確了Notch-1活化會促進細胞的生長、黏附、遷移和侵襲。闡明了Notch-1促進細胞惡性行為的機制是調(diào)控PP2A活性而調(diào)節(jié)PI3K/AKT/NF-κB信號通路的活性,進而調(diào)節(jié)下游與細胞周期、細胞凋亡和運動相關(guān)靶基因的表達。該研究闡明了Notch-1調(diào)控乳腺癌細胞遷移的機制,并為相關(guān)臨床研究提供了相應和理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：電子科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R73-37

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本文編號：1654229