本文選題：DICER　切入點：Let-7　出處：《吉林大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：目的:DICER作為mi RNA成熟過程中的關(guān)鍵酶,其功能復(fù)雜,與腫瘤的關(guān)系密切。本研究旨在明確DICER在放化療所致的DNA損傷反應(yīng)中的作用并進(jìn)行機制上的探討。方法:人成纖維細(xì)胞MRC5SV,宮頸癌細(xì)胞He La,人膠質(zhì)瘤細(xì)胞M059J(ATM低表達(dá)、DNA-PKcs表達(dá)缺失存在NHEJ缺陷),ATM-/-(HRR缺陷細(xì)胞),180BRM(Ligase4突變的NHEJ缺陷細(xì)胞),將上述細(xì)胞應(yīng)用si RNA技術(shù)敲除DICER,經(jīng)CPT處理,克隆形成實驗觀察Si DICER對CPT敏感性變化及上述細(xì)胞敲除DICER后對射線的敏感性變化。Western Blot檢測了DICER敲除后電離輻射HRR通路的關(guān)鍵蛋白:磷酸化ATM、Rad51、Rad54、XRCC2和XRCC3,NHEJ通路的關(guān)鍵蛋白:磷酸化DNA-PKcs,Artemis,Ku70,Lig4和XRCC4的表達(dá)情況。MRC5SV和He La細(xì)胞敲除DICER后,2Gy電離輻射后不同時間點ATM的磷酸化水平及Foci形成情況。Micro RNA array檢測MRC5SV DICER敲除前后mi RNA的表達(dá)變化。流式細(xì)胞術(shù)檢測DICER敲除前后細(xì)胞周期變化。Western Blot檢測細(xì)胞周期調(diào)控關(guān)鍵蛋白Cyclin E、Cyclin A、Cyclin D1、p21Waf1/Cip1/p27Kip1的表達(dá)情況。Real-Time PCR檢測DICER敲除前后p21/p27m RNA的表達(dá)情況。熒光素酶檢測p21和p27 3’UTR是否存在Let-7b的潛在作用位點。U2OS HRR reporter cells及293FT NHEJ reporter cells分別檢測DICER敲除后HRR及NHEJ修復(fù)效率。結(jié)果:(1)DICER敲除致使細(xì)胞對CPT抵抗敲除DICER使MRC5SV、He La細(xì)胞對CPT抗拒。進(jìn)一步行恢復(fù)實驗,即內(nèi)源性DICER敲除后,將Si RNA抵抗的FLAG標(biāo)簽的DICER轉(zhuǎn)入細(xì)胞中,發(fā)現(xiàn)對CPT的敏感性恢復(fù)。這些結(jié)果有力的證實DICER缺陷是細(xì)胞對CPT抗拒的主要原因。此外,其他細(xì)胞株:ATM-/-、180BRM、M059J敲除DICER后均對CPT抗拒。(2)DICER敲除使p21 Waf1/Cip1/p27 Kip1表達(dá)增加介導(dǎo)G1/S期阻滯敲除DICER后引起細(xì)胞數(shù)下降。G1期細(xì)胞對CPT更抗拒,我們檢測敲除DICER后對細(xì)胞周期的影響。敲除DICER后,在CPT處理的細(xì)胞中可介導(dǎo)G1/S阻滯。進(jìn)一步檢測了調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的相關(guān)基因表達(dá),敲除DICER后p21 Waf1/Cip1/p27Kip1、Cyclin E及Cyclin A的表達(dá)明顯增高,而敲除p21 Waf1/Cip1/p27Kip1后Cyclin E及Cyclin A的表達(dá)下降,表明Cyclin E及Cyclin A的表達(dá)依賴于p21 Waf1/Cip1/p27Kip1的存在。更重要的是,敲除DICER后,在CPT處理的細(xì)胞中介導(dǎo)的G1/S阻滯,如敲除p21 Waf1/Cip1/p27Kip1,G1/S阻滯消失,表明敲除DICER后,在CPT處理的細(xì)胞中介導(dǎo)的G1/S阻滯是由于p21和p27表達(dá)增加所致。(3)DICER依賴的Let-7合成減少致使p21 Waf1/Cip1/p27 Kip1表達(dá)增高敲除DICER后細(xì)胞p21和p27 m RNA水平無改變,但蛋白水平明顯升高,表明p21和p27水平增高發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后階段。比較了人MRC5SV敲除DICER前后mi RNA表達(dá)變化,發(fā)現(xiàn)敲除DICER后Let-7家族合成明顯減少。而Let-7b處理后的細(xì)胞p21和p27的表達(dá)水平明顯下降,表明p21和p27是Let-7的靶基因。p21和p27 3’UTR存在Let-7的潛在作用位點,熒光素酶報告檢測表明當(dāng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染對照RNA時,熒光素酶活性無變化,但當(dāng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染Let-7b時,熒光素酶活性嚴(yán)重受抑制,然而當(dāng)p21和p27 3’UTR Let-7b結(jié)合位點突變時這種抑制作用可被逆轉(zhuǎn)。除Let-7b外,人Let-7家族其他成員,都可以調(diào)控p21和p27,表明Let-7家族通過調(diào)控p21和p27來調(diào)節(jié)細(xì)胞周期。敲除DICER后過表達(dá)Let-7b,G1/S阻滯現(xiàn)象消失。(4)DICER敲除不影響細(xì)胞的放射敏感性將人M059J、180BRM、MRC5SV和He La細(xì)胞分別分別給予Ct RNA和Si DICER處理,分別給予X射線照射后,其生存率無變化。鼠細(xì)胞系,Ku80+/+(野生型)和Ku80-/-(NHEJ缺陷)也得出了相同的結(jié)果。DICER敲除后電離輻射HRR通路的關(guān)鍵蛋白:磷酸化ATM、Rad51、Rad54、XRCC2和XRCC3,NHEJ通路的關(guān)鍵蛋白:磷酸化DNA-PKcs、Artemis、Ku70、Lig4和XRCC4的表達(dá)未見明顯變化。MRC5SV和He La細(xì)胞敲除DICER后,給予2Gy電離輻射后不同時間點ATM的磷酸化水平及Foci形成情況與對照組無差異。這排除了敲除DICER介導(dǎo)的CPT抵抗與ATM蛋白水平或活性變化的可能。(5)G1/S期阻滯致使HRR效率下降,S期細(xì)胞數(shù)目減少,細(xì)胞對CPT耐藥DICER敲除后我們將Let-7b過表達(dá)或抑制p21/p27,DICER敲除的細(xì)胞對CPT的耐藥消失。HR reporter試驗顯示,敲除DCIER后,HR修復(fù)效率降低,當(dāng)轉(zhuǎn)染Let-7b或抑制p21和p27的表達(dá),DICER敲除所致的HRR效率下降這一現(xiàn)象即被逆轉(zhuǎn)。NHEJ reporter細(xì)胞株敲除DICER后其NHEJ效率增加,而敲除p21或Let-7b上調(diào)后增加的NHEJ效率消失。這些結(jié)果充分證明DICER敲除所致的HRR效率下降是由于DICER敲除后Let-7合成下降,致使p21/p27過表達(dá),G1/S期阻滯,進(jìn)入S期減少是細(xì)胞對CPT耐藥的主因。結(jié)論:(1)DICER依賴的Let-7合成減少致使p21 Waf1/Cip1/p27 Kip1表達(dá)增高,介導(dǎo)細(xì)胞周期G1/S阻滯,致使細(xì)胞對CPT抵抗。(2)腫瘤細(xì)胞DICER缺乏,通過上述機制介導(dǎo)對S期周期特異性化療藥耐藥,是拓?fù)洚悩?gòu)酶I耐藥的新機制。(3)DICER敲除不影響細(xì)胞的放射敏感性。綜上所述,本研究明確了DICER在放化療所致的DDR中的作用,發(fā)現(xiàn)了新的調(diào)控細(xì)胞周期的mi RNA,且揭示了DICER介導(dǎo)的拓?fù)洚悩?gòu)酶I耐藥的新機制,為mi RNA功能和機制的研究提供新的視角。該研究提示DICER在腫瘤的治療中有非常重要的地位,可能為根據(jù)DICER的表達(dá)情況開展腫瘤個性化治療方案提供依據(jù)。
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【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R730.5

【參考文獻(xiàn)】

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1 Christine Kestens;Peter D Siersema;Jantine WPM van Baal;;Current understanding of the functional roles of aberrantly expressed micro RNAs in esophageal cancer[J];World Journal of Gastroenterology;2016年01期

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本文編號：1654343