本文選題：EMC6　切入點(diǎn)：自噬　出處：《新疆醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：研究背景和目的:宮頸癌是威脅全球女性健康的惡性腫瘤。人乳頭狀瘤病毒的持續(xù)感染被認(rèn)為是導(dǎo)致宮頸癌的必要因素,自噬缺陷可能導(dǎo)致病毒持續(xù)感染,從而參與宮頸癌的形成和發(fā)展。另一方面,當(dāng)自噬能力下降時(shí),自噬清除衰老受損的細(xì)胞器的能力也下降,從而造成基因毒性成分積累和受損細(xì)胞器的堆積,誘發(fā)腫瘤的發(fā)生。新發(fā)現(xiàn)的重要基因EMC6(ER membrane protein complex subunit 6)對(duì)自噬具有調(diào)控作用,但其在惡性腫瘤組織中的表達(dá)及功能尚無(wú)報(bào)道。EMC6可與已發(fā)現(xiàn)的抑癌基因Beclin1及腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因Rab5a相互作用,共同參與自噬過(guò)程。因此,本實(shí)驗(yàn)研究自噬基因EMC6、Rab5a與Beclin1在宮頸癌組織中的表達(dá)及相互關(guān)系。EMC6基因表達(dá)質(zhì)粒及特異性RNA干擾質(zhì)粒在體內(nèi)、體外對(duì)宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng),自噬影響的差異及相互作用,了解在惡性腫瘤中上述基因在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用,探索自噬誘導(dǎo)在宮頸癌治療中的可行性,為將來(lái)進(jìn)行基因治療提供新靶點(diǎn)方面的線(xiàn)索,為其成為潛在宮頸癌治療策略提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法:1)采用SP法分別檢測(cè)EMC6、Beclin1、Rab5a在宮頸癌組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)、正常宮頸組織中的表達(dá)狀況,并分析EMC6表達(dá)與宮頸癌患者年齡、臨床分期、病理類(lèi)型、細(xì)胞分化程度、是否伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理因素的相關(guān)性.2)分析比較在宮頸癌組織、CIN組織、正常宮頸組織中EMC6、Beclin1及Rab5a表達(dá)之間的關(guān)系。3)構(gòu)建EMC6基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pLenti-CMV-EMC6-PGK-T2A-Puro、特異性干擾EMC6質(zhì)粒p Lenti-u6-shrna-CMV-2A-Puro、空質(zhì)粒pLenti-u6-ccdb-CMV-T2A-Puro。分別將這三種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,篩選穩(wěn)定表達(dá)株。用Real time-PCR檢測(cè)三組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后Hela細(xì)胞中EMC6mRNA表達(dá)結(jié)果。4)用透射電鏡觀察細(xì)胞株內(nèi)是否有自噬體形成。用激光共聚焦顯微鏡觀察處理組、空白質(zhì)粒組及HeLa細(xì)胞株中GFP-LC3。其后用bafilomycin A及3MA分別作用于三組HeLa細(xì)胞株,再用共焦顯微鏡觀察細(xì)胞株中GFP-LC3的變化。5)使用Real time-PCR、Western blot分別檢測(cè)EMC6基因穩(wěn)定過(guò)表達(dá)的HeLa細(xì)胞和EMC6基因穩(wěn)定不表達(dá)的HeLa細(xì)胞中Rab5a和Beclin1表達(dá)情況。6)將HeLa、HeLa-EMC6及HeLa-shRNA表達(dá)株分別接種到裸鼠皮下成瘤,建立雌性裸鼠異體移植宮頸癌模型,觀察比較三組瘤體生長(zhǎng)速度及瘤體大小及腫瘤,剝下瘤體免疫組化檢測(cè)比較三組瘤體組織中emc6蛋白、rab5a蛋白及beclin1蛋白的表達(dá)水平。7)統(tǒng)計(jì)方法:等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn),計(jì)量資料采用方差檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn),多組間兩兩比較等級(jí)資料的統(tǒng)計(jì)均采用秩和檢驗(yàn),多組數(shù)據(jù)組間兩兩比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)中的kruskal-wallis檢驗(yàn)法。相關(guān)性分析采用非參數(shù)spearman法等級(jí)相關(guān)法檢驗(yàn)。使用spss22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行運(yùn)算,以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)(雙側(cè))。結(jié)果:1)在100例宮頸癌組織中emc6蛋白表達(dá)陰性占36.0%(36/100),弱陽(yáng)性占18.0%(18/100),強(qiáng)陽(yáng)性占46.0%(46/100).在80例cin組織中emc6蛋白表達(dá)陰性占6.3%(5/80),弱陽(yáng)性占6.3%(5/80),強(qiáng)陽(yáng)性占87.5%(70/80),80例正常宮頸上皮組織emc6蛋白表達(dá)陰性為18.8%(15/80),弱陽(yáng)性占25.0%(20/80),強(qiáng)陽(yáng)性占56.2%(45/80)。emc6蛋白在宮頸癌組織中陽(yáng)性表達(dá)最低,在cin組織中陽(yáng)性表達(dá)最高,差異有顯著性(p0.05)。2)beclin1在宮頸癌組織中表達(dá)陰性占38.0%(38/100),弱陽(yáng)性占50.0%(50/100),強(qiáng)陽(yáng)性占12.0%(12/100);cin組織中表達(dá)陰性占6.25(5/80),弱陽(yáng)性占62.50%(50/80),強(qiáng)陽(yáng)性占31.25%(25/80);正常宮頸組織中表達(dá)陰性占18.75%(15/80),弱陽(yáng)性占31.25%(25/80),強(qiáng)陽(yáng)性占50.0%(40/80)。beclin1蛋白在宮頸癌組表達(dá)比例低于cin組、正常宮頸組(p0.05),cin組織中beclin1蛋白表達(dá)高于正常宮頸組織,差異有顯著性(p0.05)。3)rab5a蛋白在宮頸癌組織中表達(dá)陰性占25.0%(25/100),弱陽(yáng)性占37.0%(37/100),強(qiáng)陽(yáng)性占38.0%(38/100);cin組織中表達(dá)陰性占31.25%(25/80),弱陽(yáng)性表達(dá)占25.00%(20/80),強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)占43.75%(35/80);在正常宮頸組織陰性表達(dá)占75.00%(60/80),弱陽(yáng)性表達(dá)占17.50%(14/80),強(qiáng)陽(yáng)性的表達(dá)為7.5%(6/80)。宮頸癌組織和cin組織中rab5a蛋白表達(dá)水平高于正常宮頸組織(p0.05);而cin組織與宮頸癌組織之間無(wú)差異(p0.05)4)宮頸癌中emc6蛋白表達(dá)和beclin1表達(dá)與患者年齡、臨床分期、腫瘤大小、大體類(lèi)型、腫瘤病理類(lèi)型、細(xì)胞分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等均無(wú)相關(guān)性(p0.05)。宮頸癌中rab5a蛋白表達(dá)與臨床分期、腫瘤大小無(wú)關(guān)(p0.05),低分化組表達(dá)高于中高分化組(p0.05),伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組表達(dá)高于無(wú)淋巴結(jié)組(p0.05)。5)用免疫組化方法檢測(cè)emc6蛋白在宮頸癌組織、cin組織、正常宮頸組織中表達(dá)水平與beclin1蛋白、rab5a蛋白表達(dá)水平無(wú)關(guān)(p0.05)。6)rt-pcr法檢測(cè)轉(zhuǎn)染plenti-cmv-emc6-pgk-t2a-puro質(zhì)粒后,hela細(xì)胞中emc6mrna明顯增高(p0.05),轉(zhuǎn)染plenti-u6-shrna-cmv-t2a-puro質(zhì)粒后,hela細(xì)胞中emc6mrna明顯減低(p0.05),轉(zhuǎn)染plenti-u6-ccdb-cmv-t2a-puro(空質(zhì)粒)后,細(xì)胞中emc6mrna無(wú)明顯變化(p0.05)。7)激光共聚焦顯微鏡觀察,處理組較空質(zhì)粒組、hela細(xì)胞內(nèi)gdp-lc3明顯增多,bafilomycina1可使三組細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)gfp-lc3的聚集,以處理組內(nèi)lc3斑點(diǎn)最豐富。3-ma可使轉(zhuǎn)染處理組、空質(zhì)粒組及hela中的lc3斑點(diǎn)均出現(xiàn)降低。8)通過(guò)pcr和westernbolt方法,檢測(cè)了emc6過(guò)表達(dá)hela細(xì)胞株中rab5amrna、rab5a蛋白和beclin1mrna、beclin1蛋白表達(dá)水平增加,EMC6特異性被干擾或抑制HeLa細(xì)胞株中,Rab5amRNA、Rab5a蛋白和Beclin1mRNA、Beclin1蛋白表達(dá)下降。9)與HeLa組(未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒)裸小鼠相比,Hela-shRNA組(EMC6被干擾)裸小鼠致瘤活性明顯增強(qiáng),生長(zhǎng)加快,瘤體體積明顯變大(P0.05)。HeLa-EMC6(EMC6過(guò)表達(dá))細(xì)胞裸小鼠致瘤活性明顯降低,生長(zhǎng)減慢,瘤體體積明顯縮小(P0.05)。Hela-shRNA組裸小鼠瘤體平均重量1.03±0.12g,較He La組腫瘤增重28.75%(P0.05);HeLa-EMC6組瘤體平均重量0.39±0.14g,較HeLa組明顯減輕51.25%(P0.05)。10)免疫組化檢測(cè)顯示HeLa-EMC6組瘤體中,Rab5a蛋白、Beclin1蛋白表達(dá)高于Hela-shRNA組及He La組,Hela-shRNA組瘤體中,Rab5a蛋白、Beclin1蛋白表達(dá)低于HeLa組。結(jié)論:1)新發(fā)現(xiàn)的EMC6基因在正常宮頸組織、CIN、宮頸癌組織內(nèi)均有表達(dá)。在“正常宮頸-宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變-宮頸癌”這一連續(xù)病理過(guò)程中,CIN組織中EMC6表達(dá)升高,而在宮頸癌組織中表達(dá)下降。推測(cè)EMC6缺失可能參與了宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程,其具體機(jī)制不明。EMC6的表達(dá)與宮頸癌患者年齡、FIGO分期、腫瘤大小、腫瘤大體類(lèi)型、腫瘤病理類(lèi)型、細(xì)胞分化程度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等均無(wú)相關(guān)性,表明EMC6的降低在宮頸癌早期既已發(fā)生。2)在宮頸癌組織、CIN組織、正常宮頸組織中,EMC6蛋白表達(dá)水平與Beclin1、Rab5a蛋白表達(dá)水平無(wú)直接相關(guān)性。3)上調(diào)或下調(diào)宮頸癌細(xì)胞內(nèi)EMC6,可同時(shí)引起細(xì)胞內(nèi)Rab5a、Beclin1出現(xiàn)相應(yīng)上調(diào)或下降,推測(cè)EMC6可能位于Rab5a蛋白作用的上游,具有抑瘤作用。4)本研究通過(guò)雌性裸鼠移植瘤模型探討EMC6對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞體內(nèi)致瘤活性和生長(zhǎng)的影響。通過(guò)結(jié)果分析,EMC6蛋白在裸鼠體內(nèi)能明顯抑制He La細(xì)胞生長(zhǎng),致瘤性降低。對(duì)裸鼠瘤體進(jìn)行免疫組化檢測(cè),在過(guò)表達(dá)EMC6的較小瘤體組織中Rab5a、Beclin1表達(dá)增高,在EMC6表達(dá)下調(diào)的較大瘤體組織中Rab5a、Beclin1蛋白表達(dá)也下調(diào)。5)基于以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,推測(cè)若選擇先新發(fā)現(xiàn)EMC6作為基因治療的靶點(diǎn),既可以抑制Rab5a蛋白在癌轉(zhuǎn)移侵蝕方面的作用,同時(shí)又促進(jìn)了Beclin1自噬抑瘤作用。為宮頸癌乃至腫瘤的靶向治療提供了新的研究方向。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：新疆醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R737.33

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