本文選題：IL-8　切入點：TNBCs　出處：《重慶醫(yī)科大學》2016年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的構(gòu)建含有白細胞介素8(IL-8)基因的重組腺病毒,觀察三陰乳腺癌細胞(Triple-negative breast cancer cells,TNBCs)過表達IL-8后,細胞增殖、細胞周期、遷移能力以及體內(nèi)成瘤能力的變化,并初步探究其相關(guān)機制。方法劃痕愈合實驗檢測5株乳腺癌細胞的遷移能力,RT-PCR和ELISA法檢測細胞中內(nèi)源性IL-8 mRNA和蛋白表達水平。以人骨肉瘤143B細胞c DNA為模版,PCR擴增IL-8基因,與穿梭質(zhì)粒pAdTrack-TO4連接,電轉(zhuǎn)入AdEasier細菌中,獲得重組腺病毒質(zhì)粒pAdIL-8,酶切后轉(zhuǎn)入HEK293細胞包裝擴增并檢測滴度;AdIL-8感染Hs578T、BT549和MDA-MB-231細胞后,RT-PCR法檢測各株細胞中IL-8 mRNA水平,ELISA法檢測細胞上清液中IL-8蛋白水平;流式細胞術(shù)(flow cytometer,FCM)檢測細胞凋亡以及細胞周期情況;MTT法檢測細胞增殖活性;劃痕愈合實驗及Transwell實驗檢測細胞遷移能力。Western blot檢測過表達IL-8后對PI3K-Akt和MAPK信號通路的作用以及對CXCR1、CXCR2、E-cadherin、MMP2、Cyclin B1、Bcl-2和Caspase 3表達的影響;裸鼠皮下成瘤實驗觀察過表達IL-8對MDA-MB-231細胞成瘤能力的影響。結(jié)果5株乳腺癌細胞中Hs578T遷移最快,BT549較快,MCF7和SKBr3遷移較慢,MDA-MB-231最慢;Hs578T中IL-8表達水平最高,BT549次之,MDA-MB-231、MCF7和SKBr3 IL-8表達較低;PCR以及測序證實pAdTrack-TO4-IL-8構(gòu)建成功;pAd IL-8經(jīng)酶切證實重組正確;重組腺病毒Ad IL-8感染Hs578T、BT549和MDA-MB-231細胞后,可高表達IL-8;過表達IL-8的細胞遷移能力增強,且可將細胞周期阻滯于S期,但其增殖活性和凋亡情況無明顯變化。AdIL-8感染MDA-MB-231細胞后可激活PI3K-Akt和MAPK信號通路,其特異性受體CXCR1和CXCR2表達增加,E-cadherin表達有所減少,Caspase 3和Bcl-2表達無明顯變化,而Cyclin B1表達增加。體內(nèi)實驗表明過表達IL-8可促進腫瘤的生長。結(jié)論過表達IL-8可促進TNBCs的遷移能力及腫瘤形成能力。
[Abstract]:Objective to construct a recombinant adenovirus containing interleukin-8 (IL-8) gene and observe the changes of cell proliferation, cell cycle, migration ability and tumorigenic ability of triple-negative breast cancer cell line triple-negative breast cancer cells (IL-8) after overexpression of IL-8. Methods the migration ability of 5 breast cancer cells was detected by scratch healing assay and the expression of endogenous IL-8 mRNA and protein were detected by RT-PCR and ELISA. IL-8 gene was amplified by using c DNA of human osteosarcoma 143B cell as template. Ligated with shuttle plasmid pAdTrack-TO4 and electrotransferred into AdEasier bacteria, The recombinant adenovirus plasmid pAdIL-8 was obtained. The recombinant adenovirus plasmid pAdIL-8 was digested into HEK293 cells for packaging and amplification. The titer of Hs578TnBT-BT549 and MDA-MB-231 cells were detected by RT-PCR. The levels of IL-8 mRNA in the supernatants were detected by Elisa and the levels of IL-8 protein in supernatants were detected by Elisa. Flow cytometerus (FCM) was used to detect cell apoptosis and cell cycle. MTT assay was used to detect cell proliferation activity. The effect of IL-8 overexpression on PI3K-Akt and MAPK signaling pathway and the expression of Bcl-2 and Caspase 3 in CXCR1CXCR2CXCR2CXCR2CXCR2E-cadherin B1C1CXCR2CXCR2 and CXCR1CXCR2CXCR2CXCR2CXCR2CXCR2CXCR1CXCR1CXCR2CXCR2CXCR2C@@. The effect of overexpression of IL-8 on the tumorigenic ability of MDA-MB-231 cells was observed in nude mice. Results among the 5 breast cancer cell lines, the fastest migration of Hs578T was the fastest MCF7 and the slowest migration of SKBr3 was MDA-MB-231. The highest level of IL-8 expression in Hs578T was MDA-MB-231MCF7 and SKBr3 IL-8, followed by BT-549, MDA-MB-231MCF7 and SKBr3 IL-8. Low expression PCR and sequencing confirmed that pAdTrack-TO4-IL-8 was successfully constructed and the recombinant pAd IL-8 was confirmed by restriction endonuclease digestion. After the recombinant adenovirus Ad IL-8 was infected with Hs578TfBT549 and MDA-MB-231 cells, IL-8 was overexpressed, and the migration ability of the cells was enhanced, and the cell cycle was blocked in S phase. However, there was no significant change in proliferation activity and apoptosis. AdIL-8 infected MDA-MB-231 cells could activate PI3K-Akt and MAPK signaling pathway. The expression of CXCR1 and CXCR2 increased and the expression of E-cadherin decreased. There was no significant change in the expression of Caspase-3 and Bcl-2. In vivo, overexpression of IL-8 can promote the growth of tumor. Conclusion overexpression of IL-8 can promote the ability of TNBCs migration and tumor formation.
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9

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