本文選題：藥物代謝酶　切入點：穩(wěn)定同位素稀釋平行反應監(jiān)測質(zhì)譜法　出處：《鄭州大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景I相藥物代謝酶細胞色素P450氧化酶(cytochrome P450 oxidase,CYP450)和II相藥物代謝酶尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UDP-glucuronide transferases,UGTs)主要存在于肝臟中,參與多種內(nèi)外源性化合物(包括藥物)的代謝,Cytochrome P450 oxidoreductase(POR)和cytochrome b5(b5)作為藥物代謝酶的供電子物質(zhì)在藥物代謝中也具有重要的作用。CYP450和UGTs的多態(tài)性和含量差異是引起藥物藥效個體差異的重要因素,肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是我國常見的腫瘤之一,臨床上,肝癌及其并發(fā)癥治療時藥物的劑量需要及時調(diào)整,然而,作為劑量調(diào)整的基礎(chǔ),CYP及UGT的含量在HCC病人中是如何改變的,至今尚不完全清楚,因此,CYP450和UGTs含量的研究對肝癌病人臨床個體化治療方案的制定有重要意義。目前測定肝藥酶含量的常用方法有免疫印跡法(Western blot)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)。其中,基于抗原抗體結(jié)合原理的Western blot法和ELISA法雖具有高靈敏度的特點,但特異性抗體制備困難,并且無法同時對同一樣本中的多種蛋白定量。而LC-MS/MS不需要制備特異性抗體,并具有高通量、高特異性以及線性范圍寬等特點。本文建立了液相色譜-平行反應監(jiān)測質(zhì)譜方法(liquid chromatography parallel reaction monitoring mass spectrometry,LC-PRM/MS),與選擇反應監(jiān)測質(zhì)譜方法相比,LC-PRM/MS能夠獲得二級的所有碎片信息,并且結(jié)果能夠搜庫,保證定量的特異性。我們將建立的方法應用于肝癌病人肝硬化組織中的藥物代謝酶含量的測定,期望為肝癌病人的臨床用藥提供參考。本論文共分為兩個部分。第一部分使用穩(wěn)定同位素標記技術(shù)制備了定量肽段串聯(lián)體蛋白(Quantification concatemer,Qcon CAT);第二部分建立了平行反應監(jiān)測方法,并將該方法應用于藥物代謝酶的定量中。研究方法1.內(nèi)標肽段的制備20種藥物代謝酶和POR以及b5各挑選2-3條特異性肽段,將選出的特異性肽段串聯(lián)成為了Qcon CAT蛋白,構(gòu)建可以表達該蛋白的基因序列,將其導入大腸桿菌后使用含重標精氨酸和賴氨酸的SILAC培養(yǎng)基進行誘導表達,表達成功的重組蛋白使用GST填料進行純化,SDS-PAGE鑒定純度,并使用Trypsin進行酶解。2.內(nèi)標肽段酶切效率和標記效率的考察酶切后的肽段使用數(shù)據(jù)依賴采集模式考察酶切效率和標記效率,使用Proteome Discoverer 2.1搜庫檢索,對酶切肽段定性。3.內(nèi)標肽段的定量化學合成一條CYP1A2的標準肽段ASGNLIPQEK,使用氨基酸水解法進行定量,將含量已知的標準肽段梯度稀釋,加入等量的內(nèi)標肽段,使用液相質(zhì)譜進行檢測,計算內(nèi)標肽段的含量。4.人肝微粒體的定量及酶切使用差速離心法制備人肝微粒體(Human liver microsomes,HLMs),用Bradford法對人肝微粒體進行定量,定量后取出10μg蛋白使用Trypsin酶切26小時。5.液相-質(zhì)譜平行反應監(jiān)測方法的建立將定量后的內(nèi)標肽段與酶切后的人肝微粒體混合,使用數(shù)據(jù)依賴掃描模式,更換三根預柱,平行測定兩次,結(jié)果使用Proteome Discoverer 2.1搜庫鑒定,確定目標肽段的保留時間和定量限,并篩選用于定量的子離子。6.標準曲線的建立將Qcon CAT蛋白梯度稀釋,加入等量酶切后的人肝微粒體,使用液相色譜-平行反應監(jiān)測質(zhì)譜方法進行掃描,建立定量肽段的標準曲線。7.液相-質(zhì)譜平行反應監(jiān)測方法的應用將建立的平行反應監(jiān)測方法應用于肝癌病人肝硬化組織中藥物代謝酶含量的測定。研究結(jié)果1.重組蛋白純度鑒定及定量SDS-PAGE分析結(jié)果表示,表達的重組蛋白純度較高。使用Bradford法對重組蛋白進行定量,標準品的方程為y=9.8617x+0.1537,R2=0.9876,蛋白濃度為0.56 mg/m L。2.重組蛋白的定性使用Proteome Discoverer 2.1搜庫匹配目標蛋白質(zhì)信息,所有內(nèi)標肽段均為目標蛋白的特異性肽段,匹配情況良好。3.重組蛋白酶切效率及標記效率的考察經(jīng)分析,純化蛋白僅存在一個漏切位點,占所有肽段的10%以下,即酶切效率高,各個肽段標記的均一性良好,標記效率均達到90%。4.重組蛋白的絕對定量使用子離子y5和y4的平均值作為Qcon CAT的定量結(jié)果,即134.75fmol;與兩組定量曲線使用母離子的定量結(jié)果相差不到1.1倍。5.定量肽段保留時間和子離子的設(shè)置相同肽段使用不同色譜柱進行色譜分離時,肽段的保留時間存在的偏差,而在同一色譜柱上對相同肽段的保留時間偏差小于1分鐘。使用搜庫結(jié)果中信號強度最高的三個子離子用于肽段的定量。6.標準曲線的建立使用PRM方法建立藥物代謝酶定量肽段的標準曲線,R2值均在0.98以上,動態(tài)范圍為5-200fmol。7.肝癌病人肝硬化組織中藥物代謝酶的定量共測定12例樣本中6種藥物代謝酶的含量。CYP1A2、UGT1A1、UGT2B4、UGT2B15、POR以及b5在樣本中的含量均值分別為67.36 fmol/μg、87.25 fmol/μg、92.97 fmol/μg、53.01 fmol/μg、140.65 fmol/μg以及84.91 fmol/μg。個體差異倍數(shù)分別為6.5、5.02、5.24、4.33、6.17和4.02倍;與正常組織相比,POR在肝癌病人的肝硬化組織呈高表達,UGT1A1與UGT2B15的含量與正常組織比有所降低,且差異顯著(p0.05)。結(jié)論1.本研究構(gòu)建了串聯(lián)體蛋白,實現(xiàn)了規(guī)�；瘍�(nèi)標肽段的制備,并保證了內(nèi)標的純度與標記效率;2.建立了藥物代謝酶的PRM分析方法,在此基礎(chǔ)上建立了絕對定量的標準曲線,線性關(guān)系為0.99,動態(tài)范圍為5-200fmol;3.使用建立的方法測定了12例樣本中6種藥物代謝酶的含量,CYP1A2、UGT1A1、UGT2B4、UGT2B15、POR以及b5在樣本中的含量均值分別為67.36 fmol/μg、87.25 fmol/μg、92.97 fmol/μg、53.01 fmol/μg、140.65 fmol/μg以及84.91fmol/μg。將結(jié)果與正常組織的結(jié)果進行比較,POR在肝癌病人的肝硬化組織呈高表達,UGT1A1與UGT2B15的含量與正常組織比有所降低,且差異顯著(P0.05)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

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本文編號：1644057