本文選題：HMGA2　切入點：子宮內(nèi)膜漿液性癌　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景子宮內(nèi)膜癌(Endometrial Carcinoma, EC)是婦科最常見的惡性腫瘤,近年來其發(fā)病率逐年升高,且有年輕化的趨勢。根據(jù)臨床表現(xiàn)、病理診斷、流行病學(xué)及分子機制的不同,子宮內(nèi)膜癌被分為兩型,Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌,即子宮內(nèi)膜樣癌(Endometrial Endometrioid Carcinoma, EEC),而子宮內(nèi)膜漿液性癌(Endometrial Serous Carcinoma, ESC)是典型的Ⅱ型內(nèi)膜癌,其發(fā)病率雖僅占內(nèi)膜癌發(fā)病率的10-15%,但分化差,侵襲性高,發(fā)現(xiàn)時多為晚期,預(yù)后不良,占到內(nèi)膜癌死亡率的40%,其高死亡率與多數(shù)病例無法早期發(fā)現(xiàn)有直接關(guān)系,早期發(fā)現(xiàn)的ESC,病灶局限于宮體且無明顯肌層浸潤的,總體生存率達(dá)83-100%。相對于機制較為清楚的Ⅰ型內(nèi)膜癌,目前對ESC機制的了解仍十分有限。ESC的發(fā)生發(fā)展過程可被概括為從正常靜止期內(nèi)膜(Resting Endometrium, RE)到癌前病變子宮內(nèi)膜腺體異常增生(Endometrial Glandular Dysplasia, EmGD),再進(jìn)一步發(fā)展為其早期未浸潤階段子宮內(nèi)膜上皮內(nèi)癌(Endometrial Intraepithelial Carcinoma, EIC),最終發(fā)展為典型ESC的過程。研究表明,TP53是ESC中最常見的突變基因,突變率達(dá)90%以上,其在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起到了重要作用。ESC中其他常見的分子改變還包括HER2/neu過表達(dá)(50%以上)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)缺失(62%)、P16過表達(dá)(92%-100%)、IMP3過表達(dá)(91%)等。由于早期發(fā)現(xiàn)的ESC預(yù)后往往較好,所以早發(fā)現(xiàn)早診斷成為其治療的關(guān)鍵。最新的ESC轉(zhuǎn)基因小鼠模型(Genetically Engineered Mouse Models, GEMMs)通過特異性敲除子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞Trp53基因,成功模擬了人類ESC的發(fā)生發(fā)展過程,不但形成了典型的ESC病變,還包含一系列可識別的與人類疾病過程相似的早期病變,如癌前病變EmGD、早期未浸潤病灶EIC等。該模型的建立進(jìn)一步驗證了P53蛋白表達(dá)異常在ESC發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用,同時為ESC的機制研究提供了非常重要的工具。高遷移率族蛋白A2 (High-mobility group A2, HMGA2)是一種能與DNA中AT富集序列特異性結(jié)合的非組蛋白分子,可通過改變DNA構(gòu)象,介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄調(diào)控,因其分子量小,在聚丙烯凝膠電泳中遷移率高而得名。HMGA2在胚胎組織中高表達(dá),而在正常成人組織中基本不表達(dá)。近年來的研究表明,HMGA2在多種惡性腫瘤組織中存在過表達(dá)的現(xiàn)象,如胰腺癌、甲狀腺癌、肺癌、漿液性卵巢癌等,是一種癌胚蛋白。之前有研究表明,HMGA2在子宮內(nèi)膜癌肉瘤中也存在過表達(dá)現(xiàn)象,但其在ESC中的表達(dá)情況及是否起到促癌作用目前未有研究。因此本課題主要致力于研究HMGA2在ESC中的表達(dá)情況、發(fā)生發(fā)展過程中的作用以及是否具有早期診斷價值。研究內(nèi)容分為以下兩部分：HMGA2在子宮內(nèi)膜漿液性癌中的表達(dá)情況及其促癌作用二、HMGA2在子宮內(nèi)膜漿液性癌中的早期診斷價值第一部分HHGA2在子宮內(nèi)膜漿液性癌中的表達(dá)情況及其促癌作用研究目的之前已有研究表明HMGA2在多種惡性腫瘤中過表達(dá),如胰腺癌、甲狀腺癌、肺癌及漿液性卵巢癌等,且HMGA2能通過介導(dǎo)上皮一間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移,并與這些惡性腫瘤的不良預(yù)后有關(guān)。但HMGA2在ESC中的表達(dá)情況及是否起到促癌作用目前未有研究。本研究通過檢測ESC患者樣本中HMGA2的表達(dá)情況來探明HMGA2在ESC中是否也存在過表達(dá)現(xiàn)象,并通過調(diào)控內(nèi)膜癌細(xì)胞系中HMGA2的表達(dá)水平來檢測其對ESC增殖及浸潤轉(zhuǎn)移能力的影響。研究方法收集ESC及EEC的病例樣本,行免疫組化染色(Immunohistochemistry staining, IHC),分別觀察HMGA2在其中的表達(dá)情況。提取不同子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系的總RNA,檢測HMGA2在各細(xì)胞系中的表達(dá)情況,選取合適的細(xì)胞系(SPEC-2和Ishikawa),通過病毒轉(zhuǎn)染的方式上調(diào)HMGA2的表達(dá),或通過siRNA轉(zhuǎn)染干擾HMGA2的表達(dá)。過表達(dá)及干擾的效率得到驗證后,行MTT實驗及平板克隆形成實驗檢測內(nèi)膜癌細(xì)胞系增殖能力的改變,通過Transwell小室實驗檢測內(nèi)膜癌細(xì)胞系HMGA2過表達(dá)或干擾后遷移及侵襲能力的改變。進(jìn)一步的體內(nèi)試驗則是通過裸鼠皮下荷瘤及尾靜脈注射肺轉(zhuǎn)移模型的建立來檢測HMGA2表達(dá)改變后細(xì)胞系增殖及浸潤轉(zhuǎn)移能力的改變。結(jié)果免疫組化染色結(jié)果顯示HMGA2在ESC中的表達(dá)陽性率達(dá)66.1%(39/59),在對照的EEC樣本中陽性率僅為29.5%(18/61)。而MTT實驗、平板克隆形成實驗及體內(nèi)裸鼠皮下荷瘤實驗都顯示HMGA2過表達(dá)可提高子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系的增殖能力,裸鼠皮下荷瘤體積明顯增大。Transwell小室實驗及體內(nèi)尾靜脈注射肺轉(zhuǎn)移模型則表明HMGA2過表達(dá)可提高內(nèi)膜癌細(xì)胞系的浸潤轉(zhuǎn)移能力,HMGA2表達(dá)被干擾后,浸潤轉(zhuǎn)移能力降低。Western-Blot結(jié)果顯示HMGA2對內(nèi)膜癌細(xì)胞系浸潤轉(zhuǎn)移能力的促進(jìn)是通過調(diào)節(jié)EMT實現(xiàn)的。結(jié)論HMGA2在ESC中過表達(dá)；HMGA2能促進(jìn)內(nèi)膜癌細(xì)胞系增殖、浸潤轉(zhuǎn)移能力;HMGA2促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移是通過介導(dǎo)EMT實現(xiàn)的。第二部分 HMGA2在子宮內(nèi)膜漿液性癌中的早期診斷價值研究目的之前的研究表明ESC中最常見的基因異常是TP53基因突變,在ESC的發(fā)生發(fā)展過程中起到了關(guān)鍵作用,是目前ESC早期診斷最重要的分子標(biāo)志物。但是P53檢測并不能涵蓋ESC所有的早期病變,由于P53在EmGD、EIC階段免疫組化陽性率分別為43%、72%,所以到EIC階段,尚有30%左右的病例無法檢出。HMGA2在ESC中過表達(dá),但其發(fā)生異常的階段尚未明確,HMGA2是否為ESC發(fā)生發(fā)展過程中的早期事件有待研究。本研究通過檢測HMGA2在人類ESC各階段樣本中的表達(dá)情況來研究HMGA2在ESC中發(fā)生異常的階段,并進(jìn)一步在建立的模擬ESC發(fā)生發(fā)展過程的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中加以驗證。最后,聯(lián)合分析HMGA2與P53在ESC發(fā)生發(fā)展過程中各階段的表達(dá)情況,探討HMGA2作為ESC早期診斷分子標(biāo)志物的可能性。研究方法收集人類形態(tài)學(xué)正常子宮內(nèi)膜、癌前病變EmGD及早期未浸潤階段EIC的樣本,分別行免疫組化染色檢測HMGA2的表達(dá)情況。而后為進(jìn)一步驗證人類樣本中所得結(jié)果,通過Trp53l1/l1小鼠與Kspl.3-Cre小鼠雜交產(chǎn)生了基因型為Kspl.3-Cre/+;Trp553f1/f1的轉(zhuǎn)基因小鼠模型,特異性敲除其泌尿生殖道上皮細(xì)胞中的Trp53基因,然后觀察Trp53敲除后,小鼠子宮內(nèi)膜組織形態(tài)學(xué)的改變及HMGA2在各階段中表達(dá)情況的變化。最后,聯(lián)合分析P53及HMGA2在ESC發(fā)生發(fā)展過程中各階段的表達(dá)情況。結(jié)果人類組織免疫組化染色檢測顯示HMGA2在形態(tài)學(xué)正產(chǎn)的內(nèi)膜組織中表達(dá)少見,28例樣本中僅1例萎縮內(nèi)膜及1例正常內(nèi)膜中存在局灶性陽性。在EmGD中陽性率為41.2%(7/17),在EIC中陽性率為62.5%(5/8),到ESC中達(dá)66.1%(39/59),其陽性率呈逐漸升高趨勢,表明HMGA2過表達(dá)出現(xiàn)于ESC發(fā)生發(fā)展的早期階段。Trp53基因條件性敲除后的轉(zhuǎn)基因小鼠成功長出了包括ESC在內(nèi)的多種Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌,還包含一系列可識別的與人類疾病過程相似的早期病變,如癌前病變EmGD、早期未浸潤病灶EIC等。HMGA2在其尚未發(fā)生形態(tài)學(xué)改變的正常的小鼠內(nèi)膜組織中就有陽性表達(dá),EmGD、EIC及ESC中HMGA2均為陽性,進(jìn)一步驗證了HMGA2過表達(dá)在ESC發(fā)生發(fā)展過程中是一早期事件。HMGA2過表達(dá)最早出現(xiàn)于20周齡左右,隨著小鼠周齡增長陽性率越來越高,40-60周齡的實驗組小鼠中HMGA2表達(dá)陽性率達(dá)60.7%(17/28),而60-80周齡的實驗組小鼠中,HMGA2表達(dá)陽性率升高到84.6%(11/13)。P53及HMGA2免疫組化染色結(jié)果聯(lián)合分析顯示,HMGA2與P53聯(lián)合診斷提高了ESC的早期診斷率。結(jié)論HMGA2在ESC的發(fā)生發(fā)展過程中是一早期事件；HMGA2可作為ESC早期診斷的標(biāo)志物,與P53聯(lián)合應(yīng)用,提高早期診斷率。本論文重點闡述了HMGA2在子宮內(nèi)膜漿液性癌(ESC)發(fā)生發(fā)展過程中起到的作用,及其作為早期診斷標(biāo)志物的價值。創(chuàng)新之處主要表現(xiàn)為以下幾點：1. 檢測發(fā)現(xiàn)HMGA2在ESC中也有過表達(dá)現(xiàn)象；2. 對HMGA2在ESC發(fā)生發(fā)展中的作用進(jìn)行了詳實完整的體外、體內(nèi)實驗,驗證了其對ESC增殖、浸潤轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用,并表明HMGA2促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移是通過介導(dǎo)EMT實現(xiàn)的；3. 首次提出HMGA2在ESC中是一重要的早期事件,可作為ESC早期診斷的標(biāo)志物,與P53聯(lián)合應(yīng)用,可提高其早期診斷率；4. 首次通過轉(zhuǎn)基因小鼠模型檢測HMGA2在ESC發(fā)生發(fā)展過程中的表達(dá)情況,為ESC機制的研究提供了重要工具。本論文尚存在不足之處,也將會是我們未來的研究工作方向。主要有以下幾點：1.本論文對HMGA2促進(jìn)ESC增殖、浸潤轉(zhuǎn)移進(jìn)行了研究,但因為患者信息授權(quán)的限制,未能就HMGA2與ESC預(yù)后進(jìn)行相關(guān)性研究,對于HMGA2是否與ESC的不良預(yù)后有關(guān)仍需進(jìn)一步研究。2. 本論文對HMGA2與ESC化療耐藥是否有關(guān)未做研究,其藥物敏感性改變?nèi)孕柽M(jìn)一步的研究。3.本論文中發(fā)現(xiàn)晚期EEC中HMGA2也有過表達(dá),雖然陽性率明顯低于ESC,但HMGA2在EEC發(fā)生發(fā)展中出現(xiàn)異常的階段及HMGA2在其他類型EC中的表達(dá)情況仍需進(jìn)一步研究。4.本論文研究表明,HMGA2作為ESC的早期診斷標(biāo)志物,與P53檢測聯(lián)合應(yīng)用可提高ESC的早期診斷率,但由于樣本數(shù)量相對較少,進(jìn)一步的擴(kuò)大樣本實驗仍需進(jìn)行。5.研究表明,HMGA2的表達(dá)受到microRNA let-7的轉(zhuǎn)錄后負(fù)調(diào)控,let-7能否成為ESC靶向治療的藥物有待進(jìn)一步研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.33

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