本文選題：OK-432　切入點(diǎn)：膀胱腫瘤　出處：《華中科技大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景及目的 膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一,在世界范圍內(nèi)排在所有惡性腫瘤的第九位。據(jù)報(bào)道,全球每年大約有330,000新發(fā)病例。膀胱癌的新發(fā)病例中70%為非肌層浸潤性膀胱癌(Non-Muscle-Invasive bladder cancer, NMIBC),目前在臨床上對于非肌層浸潤性膀胱癌的治療,經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)(Transurethral Resection Of Bladder Tumor, TURBt)是治療膀胱腫瘤的金標(biāo)準(zhǔn),術(shù)后再輔助其他的藥物進(jìn)行膀胱灌注治療。膀胱灌注治療是非肌層浸潤性膀胱癌治療的重要組成部分,對預(yù)防膀胱腫瘤的復(fù)發(fā)和進(jìn)展顯得尤為重要。因此,膀胱腫瘤術(shù)后灌注的藥物選擇就顯得非常關(guān)鍵。研究一種既可以預(yù)防膀胱腫瘤復(fù)發(fā),而且對機(jī)體的副作用又小的藥物就顯得迫在眉睫。 OK-432為溶血性鏈球菌A3或SIPI722低毒變異株經(jīng)青霉素滅活、冷凍干燥等過程處理得到的滅活菌體制劑。作為一種滅活的菌體,進(jìn)入體內(nèi)能誘發(fā)機(jī)體的免疫功能,主要包括刺激巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞來而發(fā)揮抗腫瘤作用,但是其具體的作用機(jī)制還不是很明確。 本研究將OK-432與膀胱癌細(xì)胞系在體外共培養(yǎng),了解OK-432對膀胱癌細(xì)胞系增殖、凋亡、細(xì)胞周期、侵襲及轉(zhuǎn)移的影響,以及應(yīng)用OK-432進(jìn)行大鼠膀胱灌注了解OK-432在體內(nèi)對膀胱腫瘤的作用,探討OK-432對膀胱癌的抑制作用及相關(guān)的作用機(jī)制。 研究方法 1、將膀胱癌細(xì)胞系T24和EJ細(xì)胞與不同濃度OK-432(0,0.125,0.25,0.5,1,2,4ke/ml,1ke OK-432相當(dāng)于100ug凍干的鏈球菌株)共培養(yǎng)24,48,72小時(shí)后,分別應(yīng)用MTS法檢測其OD值,來研究OK-432對T24和EJ細(xì)胞增殖的影響。 2、將不同濃度OK-432(0,0.1,0.5,1ke/m1)與T24和EJ細(xì)胞作用2周后,在倒置顯微鏡下觀察其對T24和EJ細(xì)胞克隆形成的影響。 3、將1,2,4ke/ml OK-432與T24和EJ細(xì)胞作用24小時(shí)后,應(yīng)用EDU法檢測OK-432對T24和EJ細(xì)胞增殖的影響。 4、將1,2,4ke/ml OK-432與T24和EJ細(xì)胞作用24小時(shí)后,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測OK-432對T24和EJ細(xì)胞凋亡的影響,并應(yīng)用western-blot檢測相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)情況。 5、將1,2,4ke/ml OK-432與T24和EJ細(xì)胞作用24小時(shí)后,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測OK-432對T24和EJ細(xì)胞周期的影響,并應(yīng)用western-blot檢測相關(guān)周期蛋白的表達(dá)情況。 6、將1,2,4ke/ml OK-432與T24和EJ細(xì)胞作用6時(shí)后,應(yīng)用Transwell檢測OK-432對T24和EJ細(xì)胞侵襲和遷移的影響,并應(yīng)用western-blot檢測EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。 7、將1,2,4ke/ml OK-432與T24和EJ細(xì)胞作用24小時(shí)后,應(yīng)用western-blot檢測TLR4/NF-κb信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。 8、應(yīng)用MNU把大鼠誘導(dǎo)形成膀胱腫瘤后,將OK-432進(jìn)行大鼠膀胱灌注,16周后處死大鼠并取出膀胱,進(jìn)行石蠟包埋、切片、免疫組化檢測。 結(jié)果 1、MTS果發(fā)現(xiàn),0.5,1,2,4ke/ml OK-432對T24和EJ細(xì)胞抑制作用明顯,且呈現(xiàn)濃度依賴性；克隆形成實(shí)驗(yàn)研究表明,0.1,0.5,1ke/ml OK-432對T24和EJ細(xì)胞的克隆形成有抑制作用,而且呈濃度依賴性的抑制;EDU實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,1,2,4ke/ml OK-432對T24和EJ細(xì)胞的增殖有抑制作用,也呈濃度依賴性。 2、應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測OK-432對T24和EJ細(xì)胞的凋亡實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示,1,2,4ke/ml OK-432對T24和EJ細(xì)胞的促凋亡作用與正常對照組相比要顯著,且相關(guān)的凋亡蛋白cleaved caspase3, cleaved caspase7, caspase9, Bax和cleaved PARP的蛋白表達(dá)量增加,Bc1-2的蛋白表達(dá)量減少。 3、應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測OK-432對T24和EJ細(xì)胞周期研究結(jié)果顯示,OK-432可以使T24和FJ細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯在G0/G1,而且周期蛋白P15、P16的表達(dá)量F降,而Cyclin D1和Cyclin D3的表達(dá)量升高。 4、Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,1,2,4ke/ml OK-432對T24和EJ細(xì)胞的侵襲和遷移有明顯的抑制作用,且EMT相關(guān)的蛋白E-cadherin表達(dá)上調(diào),N-cadherin, MMP9, Snail, Vimentin的蛋白表達(dá)量下調(diào)。 5、Western-blot檢測TLR4/NF-κ b信號通路研究結(jié)果顯示,OK-432作用于T24和EJ細(xì)胞后,TLR4的蛋白表達(dá)量上調(diào),而p-NF-κ b和p-I κ Ba表達(dá)上調(diào)。 6、在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,MNU對大鼠進(jìn)行膀胱灌注8周后,大鼠膀胱腫瘤模型建立；后進(jìn)行OK-432膀胱灌注,16周后處死大鼠并取出膀胱組織行免疫組化檢查。結(jié)果顯示,MNU組PCNA的表達(dá)較OK-432組和正常對照組要高；TUNEL的結(jié)果顯示OK-432組細(xì)胞的凋亡陽性率比MNU組和正常對照組要高。 結(jié)論 OK-432能夠抑制膀胱腫瘤細(xì)胞系T24和EJ細(xì)胞的增殖,并促進(jìn)其凋亡,而且能夠使T24和EJ細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯在G0/G1； OK-432還能抑制T24和EJ細(xì)胞的侵襲和遷移;另外,研究發(fā)現(xiàn)OK-432可以通過TLR4/NF-κ b抑制膀胱腫瘤細(xì)胞的增殖和促進(jìn)其凋亡；而且在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)OK-432能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)其凋亡。
[Abstract]:Background and purpose of research
Bladder cancer is one of the most common malignant tumor of urinary system in the world in all malignant tumors in ninth. According to reports, there are about 330000 new cases annually. New cases of bladder cancer in 70% for non muscle invasive bladder cancer (Non-Muscle-Invasive bladder, cancer, NMIBC), currently in clinical for non muscle invasive bladder cancer treated by transurethral resection of bladder tumor (Transurethral Resection Of Bladder Tumor, TURBt) is the gold standard for the treatment of bladder tumor, postoperative auxiliary other drugs intravesical therapy. Intravesical therapy is an important part of non muscle invasive bladder cancer. Is very important for the prevention of bladder cancer recurrence and progression of bladder cancer is. Therefore, the postoperative infusion drug selection is very important. A study can prevent the recurrence of bladder cancer, and The drug that has a small side effect on the body seems imminent.
OK-432 hemolytic streptococcus A3 or mutant SIPI722 toxicity by penicillin inactivation, freeze-drying treatment process by inactivated bacteria preparation. As a kind of inactivated bacteria can enter the body by the body's immune function, including macrophages, NK cells and other immune cells to exert antitumor effect, but its the specific mechanism is not clear.
This study will be co cultured in vitro with OK-432 and bladder cancer cell lines, OK-432 proliferation of bladder cancer cell line apoptosis, cell cycle, invasion and metastasis, and the application of OK-432 to rat bladder perfusion in understanding OK-432 effect in vivo of bladder tumors, to investigate the inhibitory effect of OK-432 on bladder cancer and the related role the mechanism.
research method
1, the bladder cancer cell lines T24 and EJ cells with different concentrations of OK-432 (0,0.125,0.25,0.5,1,2,4ke/ml, 1ke OK-432 is equivalent to 100ug freeze-dried Streptococcus strains) were cultured after 24,48,72 hours, to detect the OD respectively using MTS method, to research on the influence of OK-432 on T24 and EJ cell proliferation.
2, after the action of different concentrations of OK-432 (0,0.1,0.5,1ke/m1) and T24 and EJ cells for 2 weeks, the effects on the formation of T24 and EJ cells were observed under the inverted microscope.
3, after the action of 1,2,4ke/ml OK-432 with T24 and EJ cells for 24 hours, the EDU assay was used to detect the effect of OK-432 on the proliferation of T24 and EJ cells.
4, after 24 hours of 1,2,4ke/ml OK-432 interaction with T24 and EJ cells, the effects of OK-432 on T24 and EJ cell apoptosis were detected by flow cytometry, and the expression of related apoptosis proteins was detected by Western-blot.
5, after 24 hours of 1,2,4ke/ml OK-432 interaction with T24 and EJ cells, the effects of OK-432 on T24 and EJ cell cycle were detected by flow cytometry, and the expression of related cyclin was detected by Western-blot.
6, after 6 hours of 1,2,4ke/ml OK-432 interaction with T24 and EJ cells, Transwell was used to detect the effect of OK-432 on invasion and migration of T24 and EJ cells, and Western-blot was used to detect the expression of EMT related proteins.
7, after the action of 1,2,4ke/ml OK-432 with T24 and EJ cells for 24 hours, the expression of TLR4/NF- kappa B signaling pathway related proteins was detected by Western-blot.
8, after MNU was used to induce bladder tumor in rats, OK-432 was perfused into the bladder of rats. After 16 weeks, the rats were killed and the bladder was removed. Paraffin embedded and sections were taken for immunohistochemical examination.
Result
1, MTS found 0.5,1,2,4ke/ml OK-432 on T24, and EJ cells were significantly inhibited, and in a concentration dependent manner; clone formation experiment, 0.1,0.5,1ke/ml OK-432 T24 and cloning of EJ cells can inhibit the formation, but also showed a concentration dependent inhibition; experimental results show that the EDU can inhibit the proliferation of T24 1,2,4ke/ml OK-432 and EJ cells, but also in a concentration dependent manner.
2, detection of OK-432 on T24 and EJ cell apoptosis by flow cytometry showed that 1,2,4ke/ml, T24 and OK-432 on EJ cell apoptosis compared with normal control group significantly, and the apoptosis protein cleaved Caspase3, cleaved caspase7, caspase9, Bax and cleaved expression and PARP protein expression increased the Bc1-2 protein decreased.
3, flow cytometry was used to detect the cell cycle of OK-432 and T24 and EJ. The results showed that OK-432 could arrest the cell cycle of T24 and FJ cells in G0/G1, and the expression of cyclin P15 and P16 decreased, while the expression of Cyclin and P15 increased.
4, Transwell results showed that 1,2,4ke/ml OK-432 significantly inhibited the invasion and migration of T24 and EJ cells, and EMT related protein E-cadherin expression was upregulated, and N-cadherin, MMP9, Snail, and Vimentin protein expression was downregulated.
5, Western-blot detected the TLR4/NF- kappa B signaling pathway. The results showed that after OK-432 acted on T24 and EJ cells, the TLR4 protein expression increased, while p-NF- kappa B and p-I kappa Ba expression increased.
6, in vivo, MNU on rat bladder perfusion 8 weeks after the establishment of rat model of bladder tumors; after OK-432 instillation, the rats were killed after 16 weeks and remove the bladder tissue by immunohistochemical examination. The results showed that the expression of PCNA in MNU group than in OK-432 group and normal control group to high TUNEL; the results showed that the positive rate of cell apoptosis in OK-432 group was higher than MNU group and normal control group.
conclusion
OK-432 can inhibit bladder cancer cell line T24 and EJ cell proliferation and promote apoptosis, but also can make the cell cycle of T24 cells and EJ cells arrest in G0/G1; OK-432 can inhibit the invasion and migration of T24 cells and EJ cells; in addition, it was found that OK-432 could inhibit TLR4/NF- by kappa B bladder tumor cell proliferation and promote apoptosis; but also confirmed that OK-432 can inhibit the proliferation and promote the apoptosis of tumor cells in vivo.

【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.14

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本文編號：1644328