本文選題：胃癌　切入點(diǎn)：CHIP　出處：《蘇州大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的本研究試圖闡明E3泛素化連接酶CHIP在胃癌細(xì)胞株AGS細(xì)胞中的作用以及探討其潛在的生物學(xué)機(jī)制。方法應(yīng)用q RT-PCR、Western blot以及IHC等方法檢測胃癌組織中CHIP的表達(dá)情況。采用慢病毒感染宿主細(xì)胞的方法轉(zhuǎn)染MSCV-GFP-h CHIP質(zhì)粒并建立穩(wěn)定高表達(dá)CHIP的胃癌細(xì)胞株AGS-h CHIP。通過x CELLigence系統(tǒng)實(shí)時(shí)動態(tài)觀察CHIP高表達(dá)后細(xì)胞生長、細(xì)胞遷移以及細(xì)胞侵襲能力的變化。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測CHIP高表達(dá)后細(xì)胞周期的變化。采用Ki-67染色法以及TUNEL法檢測CHIP高表達(dá)后細(xì)胞增殖以及細(xì)胞凋亡的變化。通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察CHIP高表達(dá)后細(xì)胞遷移能力的變化。采用明膠酶譜MMP活性檢測方法檢測CHIP高表達(dá)后細(xì)胞內(nèi)金屬蛋白酶活性的變化。應(yīng)用q RT-PCR及Western blot技術(shù)檢測相關(guān)基因在m RNA水平以及蛋白水平的表達(dá)。通過Western blot技術(shù)檢測CHIP高表達(dá)后對細(xì)胞內(nèi)AKT信號通路相關(guān)蛋白以及TRAF-NF-κB信號通路相關(guān)家族成員蛋白水平的表達(dá)。結(jié)果胃癌組織中CHIP在m RNA水平以及蛋白質(zhì)水平的表達(dá)均較正常組織呈相對低表達(dá),且CHIP的表達(dá)量與胃癌的分化程度及TNM分期有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。在胃癌細(xì)胞株AGS中分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MSCV-GFP-h CHIP質(zhì)粒和MSCV-GFP質(zhì)粒,成功獲得實(shí)驗(yàn)組穩(wěn)定高表達(dá)CHIP的AGS-h CHIP細(xì)胞和對照組AGS-control細(xì)胞。AGS-h CHIP細(xì)胞的生長速度明顯慢于AGS-control細(xì)胞,并且遷移、侵襲能力均較AGS-control細(xì)胞顯著減弱。AGS-h CHIP細(xì)胞與AGS-control細(xì)胞在細(xì)胞周期上無明顯差異。AGS-h CHIP細(xì)胞的增殖能力較AGS-control細(xì)胞顯著減弱。AGS-h CHIP細(xì)胞的凋亡細(xì)胞百分比較AGS-control細(xì)胞明顯增多。AGS-h CHIP細(xì)胞中ITGB1基因在m RNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)均較AGS-control細(xì)胞顯著下調(diào)。AGS-h CHIP細(xì)胞中的MMP-2、MMP-9蛋白質(zhì)水平的表達(dá)均較AGS-control細(xì)胞顯著下調(diào),同時(shí)明膠酶譜MMP活性檢測方法檢測顯示AGS-h CHIP細(xì)胞中MMP-2和MMP-9的表達(dá)顯著低于AGS-control細(xì)胞。AGS-h CHIP細(xì)胞中Bcl-2基因在m RNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)均較AGS-control細(xì)胞明顯下調(diào),其余相關(guān)基因Bcl-xl、c IAP1、Bax、A20、Bim、Mcl-1在m RNA水平的表達(dá)無明顯變化。AGS-h CHIP細(xì)胞中p AKT(Ser473)及p AKT(Thr308)的蛋白表達(dá)水平較AGS-control細(xì)胞呈明顯下調(diào)。AGS-h CHIP細(xì)胞中Rel A、p50、Rel B及TRAF-2的蛋白表達(dá)水平較AGS-control細(xì)胞顯著下調(diào)。結(jié)論CHIP在胃癌的發(fā)生發(fā)展中扮演著抑癌基因的角色,可以作為判斷胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移以及患者預(yù)后的參考指標(biāo)。在胃癌細(xì)胞株AGS細(xì)胞中高表達(dá)CHIP能顯著抑制細(xì)胞的生長、遷移以及侵襲等惡性生物學(xué)行為。高表達(dá)CHIP顯著抑制了胃癌細(xì)胞株AGS細(xì)胞的生長,與細(xì)胞增殖能力減弱及細(xì)胞凋亡增多相關(guān),Bcl-2基因的下調(diào)及AKT信號通路活性的抑制可能是其潛在的原因。高表達(dá)CHIP顯著抑制了AGS胃癌細(xì)胞株中TRAF-2-NF-κB信號通路的活性,導(dǎo)致了NF-κB信號通路下游一系列靶基因如ITGB1、MMP-2及MMP-9表達(dá)水平的下調(diào),這可能是CHIP抑制胃癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的重要機(jī)制之一。CHIP有望作為胃癌分子靶向治療的新靶點(diǎn),應(yīng)用CHIP高表達(dá)技術(shù)可以成為一種潛在的胃癌基因治療的手段。
[Abstract]:Objective to elucidate the E3 ubiquitin ligase CHIP in gastric cancer cell line AGS cells and investigate its biological mechanisms underlying this study. Methods Q RT-PCR CHIP was used to detect the expression of Western in gastric cancer tissue blot and IHC method. The lentivirus infected host cells transfected with MSCV-GFP-h plasmid CHIP method and the establishment of gastric cancer cells line AGS-h CHIP. CHIP high stable expression of growth by real-time x CELLigence system dynamic observation of the high expression of CHIP cells, changes of cell migration and cell invasion. CHIP detected by flow cytometry after high expression of cell cycle. Ki-67 staining was used to detect CHIP method and TUNEL method of high expression of apoptosis and cell proliferation by cell scratch experimental observation of high CHIP expression changes after cell migration. Gelatin zymography detection method to detect the activity of MMP CHIP High expression of metalloproteinase activity in cells was detected by Q. RT-PCR and Western blot related genes in M RNA mRNA and protein expression detected by CHIP Western. Blot technology of high expression on intracellular AKT signaling pathway related protein and member of the TRAF-NF- B signaling pathway related proteins. Results the expression level of CHIP in gastric cancer at M RNA level and protein expression level were lower than that of the normal tissue showed relatively low expression, differentiation and expression of TNM and gastric cancer and CHIP staging with significant difference (P0.05) in gastric cancer cell line AGS were transfected with MSCV-GFP-h CHIP plasmid and MSCV-GFP plasmid, the experimental group successfully obtained high stability the expression of CHIP AGS-h CHIP cells and AGS-control cells of control group.AGS-h CHIP cell growth was slower than AGS-control cells, and the migration, invasion to Force was significantly lower in the AGS-control cells decreased the percentage of apoptotic AGS-control cells.AGS-h cells CHIP cells and AGS-control cells in the cell cycle did not differ significantly between the.AGS-h CHIP cell proliferation ability of AGS-control cells was significantly decreased compared with.AGS-h CHIP cells significantly increased the expression of ITGB1.AGS-h gene in CHIP cells in M RNA and protein levels were significantly lower than that of AGS-control cells.AGS-h CHIP MMP-2 in the cells and MMP-9 protein expression levels were significantly lower than that of AGS-control cells, and zymography method for detection of MMP activity detection showed that expression of MMP-2 and MMP-9 AGS-h in CHIP cells was significantly lower than that of Bcl-2 AGS-control cell.AGS-h gene in CHIP cells in m RNA and protein levels were significantly lower than that of AGS-control cells, the C IAP1, gene Bcl-xl, Bax, A20, Bim, Mcl-1 expression in m level of RNA had no obvious change .AGS-h CHIP P AKT cells (Ser473) and P AKT (Thr308) protein expression level was higher than that of AGS-control cells showed a significant down-regulation of.AGS-h CHIP cells in Rel A, P50, Rel B and TRAF-2 protein expression was significantly down regulated in AGS-control cells. Conclusion CHIP in gastric cancer suppressor gene plays a role in the development of that can be used to judge the invasion, metastasis and prognosis of patients with the reference index. The high expression of CHIP can inhibit cell growth in gastric cancer cell line AGS cells, the malignant biological behavior of migration and invasion. The high expression of CHIP significantly inhibited the growth of gastric cancer cell line AGS cells, associated with cell proliferation and apoptosis increased weakened the down-regulation of AKT signaling pathway, and the activity of Bcl-2 gene may be the underlying cause. The high expression of CHIP significantly inhibited the TRAF-2-NF- activity of the B signaling pathway in gastric cancer cell lines AGS in the guide The NF- B signaling pathway downstream of a series of target genes such as ITGB1, MMP-2 and MMP-9 expression, which may be an important mechanism of CHIP inhibits the malignant biological behavior of gastric cancer cells.CHIP gastric cancer is expected as a new target for molecular therapy, high expression of CHIP can be used as a potential gene therapy of gastric cancer means.

【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.2

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本文編號：1632426