發(fā)布時(shí)間：2018-03-17 23:00

  本文選題：CACNA2D1　切入點(diǎn)：胃癌　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：胃癌是世界上常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,據(jù)文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì),2012年有951600例新發(fā)胃癌病例,胃癌死亡病例則高達(dá)723100例。隨著醫(yī)學(xué)治療相關(guān)研究的發(fā)展,化療藥物對(duì)胃癌的治療效果越來(lái)越顯著,但胃癌的多藥耐藥現(xiàn)象成為影響胃癌患者治療效果的重要難題。為了解決胃癌多藥耐藥導(dǎo)致的治療難題,研究人員進(jìn)行了大量的研究。本實(shí)驗(yàn)室也正在開(kāi)展一系列更加深入的研究工作。目前我們已建立了多株胃癌耐藥細(xì)胞亞系,并應(yīng)用糖蛋白組學(xué)鑒定和lnc RNA芯片,成功篩選鑒定出一系列耐藥相關(guān)基因和分子。因?yàn)槲赴┑亩嗨幠退帣C(jī)制十分復(fù)雜,我們篩選出的耐藥相關(guān)基因和分子不能完全闡明胃癌多藥耐藥發(fā)生發(fā)展的過(guò)程。正確的糖基化修飾方式是維持蛋白質(zhì)正常生物活性的基礎(chǔ),糖基化修飾錯(cuò)誤會(huì)導(dǎo)致糖蛋白的合成減少或功能喪失。已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道在多種腫瘤中糖基化修飾在多藥耐藥發(fā)生過(guò)程中扮演了重要角色。近期,越來(lái)越多的研究人員將目光聚焦于糖蛋白對(duì)腫瘤的影響,因此我們選取多株胃癌耐藥系,通過(guò)糖蛋白捕獲策略鑒定出11個(gè)表達(dá)差異明顯的糖蛋白。這些糖蛋白很可能是預(yù)測(cè)胃癌多藥耐藥的生物標(biāo)志物或者具有關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。CACNA2D1是表達(dá)差異最明顯的糖蛋白之一。查閱文獻(xiàn),我們發(fā)現(xiàn)CACNA2D1主要在神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)方面發(fā)揮重要作用,目前關(guān)于CACNA2D1分子及其糖基化在胃癌多藥耐藥中的作用及機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道,我們將在本研究中對(duì)CACNA2D1的糖基化修飾與胃癌多藥耐藥的關(guān)系進(jìn)行初步探討。目的明確CACNA2D1在胃癌組織內(nèi)表達(dá)及與臨床預(yù)后的關(guān)系;探討CACNA2D1表達(dá)變化對(duì)胃癌細(xì)胞耐藥的作用及相關(guān)機(jī)制;研究糖基化修飾改變對(duì)CACNA2D1調(diào)節(jié)胃癌耐藥功能的影響,最終初步闡明CACNA2D1作為糖蛋白參與調(diào)節(jié)胃癌多藥耐藥惡性表型的作用路徑。方法1.免疫組織化學(xué)檢測(cè)CACNA2D1在胃癌組織內(nèi)的表達(dá),并采用Kaplan-Meier方法分析CACNA2D1與胃癌患者臨床預(yù)后之間的聯(lián)系。2.q RT-PCR和Western-blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CACNA2D1在胃癌耐藥細(xì)胞系及其親本細(xì)胞系的表達(dá)。3.擴(kuò)增和鑒定CACNA2D1正義和反義載體,并建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系,通過(guò)MTT方法、凋亡實(shí)驗(yàn)和藥物泵出實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CACNA2D1表達(dá)改變后,對(duì)細(xì)胞功能的影響。4.擴(kuò)增和鑒定CACNA2D1的糖基化位點(diǎn)突變載體,并建立相關(guān)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。通過(guò)MTT和藥物泵出實(shí)驗(yàn)檢測(cè)糖基化位點(diǎn)改變后,CACNA2D1的功能影響是否改變。結(jié)果1、CACNA2D1在胃癌組織中高表達(dá)與胃癌病人的預(yù)后密切相關(guān)q RT-PCR檢測(cè)了16對(duì)新鮮胃癌組織及配對(duì)的癌旁組織,發(fā)現(xiàn)CACNA2D1在胃癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織。同時(shí),免疫組織化學(xué)檢測(cè)CACNA2D1在89例胃癌和癌旁組織內(nèi)表達(dá),結(jié)果顯示CACNA2D1在43例胃癌組織中呈陽(yáng)性表達(dá),表達(dá)陽(yáng)性率為48.3%,明顯高于配對(duì)的癌旁組織的表達(dá)陽(yáng)性率13.4%(12/89)。統(tǒng)計(jì)學(xué)單因素分析發(fā)現(xiàn)CACNA2D1與胃癌患者臨床預(yù)后存在聯(lián)系,CACNA2D1表達(dá)陽(yáng)性的胃癌患者生存期較短。(p0.05)2、CACNA2D1在胃癌耐藥細(xì)胞中的表達(dá)升高我們通過(guò)q RT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CACNA2D1在胃癌耐藥細(xì)胞系SGC7901/VCR、SGC7901/ADR和其親本細(xì)胞SGC7901中的表達(dá)水平,結(jié)果顯示在胃癌耐藥細(xì)胞系中,CACNA2D1的表達(dá)明顯高于親本細(xì)胞,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn),在耐藥細(xì)胞中,CACNA2D1的糖基化修飾程度要高于親本細(xì)胞中。3、CACNA2D1可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞的耐藥我們通過(guò)MTT檢測(cè)細(xì)胞IC50發(fā)現(xiàn)在胃癌耐藥細(xì)胞系中降低CACNA2D1的表達(dá)后,細(xì)胞對(duì)ADR、5-fu和CDDP等化療藥物的敏感性均明顯上升;而上調(diào)親本細(xì)胞系中CACNA2D1的表達(dá)則可以顯著降低胃癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示,胃癌耐藥細(xì)胞系中CACNA2D1表達(dá)下調(diào)后,凋亡細(xì)胞明顯增多,提示下調(diào)CACNA2D1可以增強(qiáng)耐藥細(xì)胞對(duì)5-fu的藥物敏感性;反之,在親本細(xì)胞系中上調(diào)CACNA2D1表達(dá)則可以降低胃癌細(xì)胞對(duì)5-fu的藥物敏感性。同樣,藥物泵出實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,抑制CACNA2D1的表達(dá)后耐藥細(xì)胞藥物泵出能力減弱;而上調(diào)CACNA2D1,胃癌細(xì)胞對(duì)阿霉素泵出能力明顯下降。4、CACNA2D1的糖基化修飾可以促進(jìn)胃癌多藥耐藥通過(guò)基因定點(diǎn)突變我們成功構(gòu)建了CACNA2D1糖基化位點(diǎn)突變載體并進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染,MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,突變的CACNA2D1蛋白對(duì)藥物的耐受能力明顯低于野生型的CACNA2D1蛋白;藥物泵出實(shí)驗(yàn)顯示,突變的CACNA2D1蛋白藥物泵出能力減弱。結(jié)論1、在配對(duì)的胃癌癌旁組織中,CACNA2D1在胃癌組織的表達(dá)水平及強(qiáng)度明顯高于癌旁組織;統(tǒng)計(jì)學(xué)分析提示CACNA2D1與胃癌患者生存預(yù)后呈負(fù)相關(guān)聯(lián)系。2、CACNA2D1在胃癌耐藥細(xì)胞系中的表達(dá)明顯高于親本細(xì)胞,且以高糖基化形式存在。3、上調(diào)胃癌細(xì)胞中CACNA2D1的表達(dá)可以通過(guò)改變藥物泵出,從而明顯促進(jìn)耐藥表型的產(chǎn)生。4、同野生型CACNA2D1相比,降低其糖基化修飾水平可明顯抑制CACNA2D1對(duì)胃癌細(xì)胞耐藥的促進(jìn)作用,提示糖基化修飾在CACNA2D1調(diào)控胃癌耐藥過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.2

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1 王凱;CACNA2D1的糖基化修飾與胃癌多藥耐藥的發(fā)生[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2015年

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本文編號(hào)：1626854