本文選題：Nanogp8　切入點：上皮間質轉化　出處：《天津醫(yī)科大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的:許多研究發(fā)現乳腺癌病人死亡的重要原因是發(fā)生了腫瘤的轉移以及腫瘤的復發(fā)。最近證實上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的發(fā)生是造成腫瘤轉移以及復發(fā)的重要分子機制。近年許多研究發(fā)現,Nanog這一維持胚胎干細胞多潛能性的核心干性轉錄因子在腫瘤細胞EMT及轉移的過程中作為重要的調控因子發(fā)揮著作用。在不同類型的腫瘤中,Nanog是由其親本基因Nanog1和逆基因Nanogp8以不同的比例參與編碼的。在我們本次研究中,我們研究發(fā)現,乳腺癌細胞中表達的Nanog僅僅來源于其假基因Nanogp8的編碼轉錄,而且定位于細胞核中。盡管如此,Nanogp8是否像Nanog一樣發(fā)揮著轉錄因子的功能并且參與到乳腺癌EMT過程中以及其詳盡的分子機制還不清楚。在本次研究中我們擬采用基于慢病毒的sh RNA干擾等一系列分子生物學和細胞生物學研究技術、并結合細胞EMT發(fā)生模型及免疫缺陷小鼠轉移模型分析探討Nanogp8在乳腺癌EMT過程中的調控作用及其詳盡的分子機制。方法:1)采用核酸序列分析的方法探究乳腺癌細胞中表達的Nanog的來源;通過免疫熒光實驗來觀察乳腺癌細胞中Nanog的定位。2)通過Western blotting來分析乳腺癌細胞系MCF-7、T47D和MDA-MB-231中Nanogp8的表達水平;基于慢病毒技術提高乳腺癌細胞MDA-MB-231中Nanogp8表達水平,并觀察細胞形態(tài)學變化;通過Western blotting和RT-PCR技術來檢測上調Nanogp8后,乳腺癌細胞中EMT相關分子指標的表達水平變化;采用免疫熒光染色進一步觀察乳腺癌細胞中Nanogp8表達上調對EMT相關分子指標的定位及表達的影響;采用transwell小室體外遷移、侵襲實驗來檢測乳腺癌MDA-MB-231細胞高表達Nanogp8后其遷移和侵襲能力的變化。3)采用基于慢病毒的sh RNA在乳腺癌T47D細胞系中降表達Nanogp8,觀察細胞形態(tài)學變化;通過Western blotting和RT-PCR技術來檢測下調Nanogp8后,乳腺癌細胞中EMT相關分子指標的表達水平變化;采用免疫熒光染色進一步觀察乳腺癌細胞中Nanogp8表達下調對EMT相關分子指標的定位及表達的影響;對乳腺癌Nanogp8穩(wěn)定降表達的T47D細胞采用transwell小室體外遷移、侵襲實驗來檢測下調Nanogp8后細胞的遷移以及侵襲能力的變化情況。4)觀察Nanogp8穩(wěn)定降表達的細胞及對照組細胞在SCID小鼠中轉移能力的變化。通過動物體內實驗探究Nanogp8下調對乳腺癌細胞轉移能力的影響。5)通過生物信息學分析及雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)和Chip技術來探究Nanogp8對Snail的啟動子活性是否有直接調控作用。6)運用Western blotting和transwell小室體外侵襲實驗來檢測在下調Nanogp8的基礎上,再下調Snail后乳腺癌細胞T47D中EMT相關分子指標的變化及細胞侵襲能力的變化。7)采用生物信息學分析及雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)和Chip技術來驗證Nanogp8對E-cadherin的啟動子活性是否有直接調控作用.8)運用生物信息學分析及雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)和Chip技術來探究STAT3對Nanogp8的啟動子活性是否有直接調控作用.9)采用Western blotting和RT-PCR技術來檢測STAT3降表達后乳腺癌細胞中Nanogp8蛋白及m RNA表達水平的變化;通過免疫熒光實驗來觀察STAT3降表達后乳腺癌細胞中Nanogp8定位變化。10)通過基于慢病毒的sh RNA技術篩選STAT3降表達的穩(wěn)定乳腺癌細胞系,并觀察細胞形態(tài)變化;通過Western blotting和RT-PCR技術來檢測降表達STAT3后,乳腺癌細胞中EMT相關分子指標的表達變化;采用免疫熒光染色進一步觀察乳腺癌細胞中STAT3表達下調對EMT相關分子指標的定位及表達的影響;采用transwell小室體外遷移、侵襲實驗及劃痕實驗來檢測乳腺癌細胞降表達STAT3后其遷移和侵襲能力的變化;在免疫缺陷小鼠轉移模型中研究下調STAT3的表達對乳腺癌細胞轉移能力的影響。11)運用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)探究STAT3對Nanogp8轉錄活性的調控作用;采用Western blotting和transwell小室體外侵襲實驗檢測在下調Nanogp8的基礎上,再下調STAT3后乳腺癌細胞T47D中EMT相關分子指標的變化及細胞侵襲能力的變化。12)通過免疫缺陷小鼠轉移模型來檢測乳腺癌T47D中同時下調Nanogp8和STAT3后,細胞在動物體內轉移能力的變化。結果:1)通過核酸序列測序比對,發(fā)現乳腺癌細胞中表達的Nanog僅來源于其逆基因Nanogp8的編碼,而且和Nanog一樣屬于核定位。2)Nanogp8的蛋白表達水平在乳腺癌細胞系MCF-7中顯著高于T47D和MDA-MB-231,后兩者中前者略高于后者;當在乳腺癌MDA-MB-231細胞中上調Nanogp8后,細胞形態(tài)由原來的長梭形變?yōu)檫B接較為緊密的鵝卵石樣,即發(fā)生了顯著的間質上皮轉化(mesenchymal-epithelial transition,MET),EMT相關分子指標也發(fā)生了一致性的變化而且細胞的體外遷移和侵襲能力顯著降低。3)在T47D中降表達Nanogp8后細胞發(fā)生了明顯的EMT現象,且EMT相關分子指標也發(fā)生了一致性的變化即E-cadherin表達顯著下降,間質指標Vimentin和Snail明顯升高而且細胞的體外遷移和侵襲能力也顯著增強。4)下調Nanogp8顯著增強了乳腺癌T47D細胞的體內轉移能力。5)Nanogp8在Snail的啟動子區(qū)存在結合位點且直接抑制Snail啟動子活性。6)下調Snail的表達沒有顯著地逆轉由Nanogp8降表達引發(fā)的乳腺癌細胞EMT,細胞的體外侵襲能力也沒有十分明顯的減弱。7)Nanogp8在E-cadherin的啟動子區(qū)存在結合位點且直接加強E-cadherin的啟動子活性。8)STAT3在Nanogp8的啟動子區(qū)存在結合位點且直接抑制Nanogp8的啟動子活性。9)下調STAT3的表達后,乳腺癌細胞中Nanogp8的蛋白和m RAN表達水平明顯提高,而Nanog P8仍為核定位。10)在乳腺癌MDA-MB-231和T47D細胞中下調STAT3后,細胞均發(fā)生了MET現象,其EMT相關指標均發(fā)生了一致性的變化,細胞遷移及侵襲能力顯著減弱,而且STAT3降表達明顯抑制了細胞體內轉移能力。11)下調STAT3的表達顯著增強了Nanogp8的轉錄活性。STAT3的下調不能逆轉由Nanogp8下調引發(fā)的乳腺癌EMT。12)下調STAT3不影響Nanogp8穩(wěn)定降表達細胞的體內轉移能力。結論:本課題組研究發(fā)現外源性高表達Nanogp8使乳腺癌細胞發(fā)生MET現象,而降表達Nanogp8明顯的促進了乳腺癌EMT過程,同時也增強了乳腺癌細胞體外的遷移、侵襲能力和動物體內的轉移能力。而且,我們進一步發(fā)現Nanogp8負調控乳腺癌EMT過程是通過直接抑制轉錄因子Snail的啟動子活性,這個轉錄因子是E-cadherin表達的重要抑制因子;或者通過直接抑制E-cadherin的啟動子活性,而E-cadherin在腫瘤發(fā)生EMT過程中起到的“守門員”的作用。另外,我們證實STAT3通過直接抑制Nanogp8的啟動子活性和轉錄活性來充當上游調控因子,參與到Nanogp8負調控乳腺癌EMT的過程中。我們的研究揭示了一條新的存在于乳腺癌EMT及轉移過程中的信號通路即STAT3/Nanogp8/E-cadherin信號軸。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R737.9

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本文編號：1627379