發(fā)布時(shí)間：2018-03-18 01:23

  本文選題：Nanogp8　切入點(diǎn)：上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化　出處：《天津醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:許多研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌病人死亡的重要原因是發(fā)生了腫瘤的轉(zhuǎn)移以及腫瘤的復(fù)發(fā)。最近證實(shí)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的發(fā)生是造成腫瘤轉(zhuǎn)移以及復(fù)發(fā)的重要分子機(jī)制。近年許多研究發(fā)現(xiàn),Nanog這一維持胚胎干細(xì)胞多潛能性的核心干性轉(zhuǎn)錄因子在腫瘤細(xì)胞EMT及轉(zhuǎn)移的過程中作為重要的調(diào)控因子發(fā)揮著作用。在不同類型的腫瘤中,Nanog是由其親本基因Nanog1和逆基因Nanogp8以不同的比例參與編碼的。在我們本次研究中,我們研究發(fā)現(xiàn),乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)的Nanog僅僅來源于其假基因Nanogp8的編碼轉(zhuǎn)錄,而且定位于細(xì)胞核中。盡管如此,Nanogp8是否像Nanog一樣發(fā)揮著轉(zhuǎn)錄因子的功能并且參與到乳腺癌EMT過程中以及其詳盡的分子機(jī)制還不清楚。在本次研究中我們擬采用基于慢病毒的sh RNA干擾等一系列分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究技術(shù)、并結(jié)合細(xì)胞EMT發(fā)生模型及免疫缺陷小鼠轉(zhuǎn)移模型分析探討Nanogp8在乳腺癌EMT過程中的調(diào)控作用及其詳盡的分子機(jī)制。方法:1)采用核酸序列分析的方法探究乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)的Nanog的來源;通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)來觀察乳腺癌細(xì)胞中Nanog的定位。2)通過Western blotting來分析乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、T47D和MDA-MB-231中Nanogp8的表達(dá)水平;基于慢病毒技術(shù)提高乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中Nanogp8表達(dá)水平,并觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化;通過Western blotting和RT-PCR技術(shù)來檢測(cè)上調(diào)Nanogp8后,乳腺癌細(xì)胞中EMT相關(guān)分子指標(biāo)的表達(dá)水平變化;采用免疫熒光染色進(jìn)一步觀察乳腺癌細(xì)胞中Nanogp8表達(dá)上調(diào)對(duì)EMT相關(guān)分子指標(biāo)的定位及表達(dá)的影響;采用transwell小室體外遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞高表達(dá)Nanogp8后其遷移和侵襲能力的變化。3)采用基于慢病毒的sh RNA在乳腺癌T47D細(xì)胞系中降表達(dá)Nanogp8,觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化;通過Western blotting和RT-PCR技術(shù)來檢測(cè)下調(diào)Nanogp8后,乳腺癌細(xì)胞中EMT相關(guān)分子指標(biāo)的表達(dá)水平變化;采用免疫熒光染色進(jìn)一步觀察乳腺癌細(xì)胞中Nanogp8表達(dá)下調(diào)對(duì)EMT相關(guān)分子指標(biāo)的定位及表達(dá)的影響;對(duì)乳腺癌Nanogp8穩(wěn)定降表達(dá)的T47D細(xì)胞采用transwell小室體外遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)下調(diào)Nanogp8后細(xì)胞的遷移以及侵襲能力的變化情況。4)觀察Nanogp8穩(wěn)定降表達(dá)的細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞在SCID小鼠中轉(zhuǎn)移能力的變化。通過動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探究Nanogp8下調(diào)對(duì)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響。5)通過生物信息學(xué)分析及雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)和Chip技術(shù)來探究Nanogp8對(duì)Snail的啟動(dòng)子活性是否有直接調(diào)控作用。6)運(yùn)用Western blotting和transwell小室體外侵襲實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)在下調(diào)Nanogp8的基礎(chǔ)上,再下調(diào)Snail后乳腺癌細(xì)胞T47D中EMT相關(guān)分子指標(biāo)的變化及細(xì)胞侵襲能力的變化。7)采用生物信息學(xué)分析及雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)和Chip技術(shù)來驗(yàn)證Nanogp8對(duì)E-cadherin的啟動(dòng)子活性是否有直接調(diào)控作用.8)運(yùn)用生物信息學(xué)分析及雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)和Chip技術(shù)來探究STAT3對(duì)Nanogp8的啟動(dòng)子活性是否有直接調(diào)控作用.9)采用Western blotting和RT-PCR技術(shù)來檢測(cè)STAT3降表達(dá)后乳腺癌細(xì)胞中Nanogp8蛋白及m RNA表達(dá)水平的變化;通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)來觀察STAT3降表達(dá)后乳腺癌細(xì)胞中Nanogp8定位變化。10)通過基于慢病毒的sh RNA技術(shù)篩選STAT3降表達(dá)的穩(wěn)定乳腺癌細(xì)胞系,并觀察細(xì)胞形態(tài)變化;通過Western blotting和RT-PCR技術(shù)來檢測(cè)降表達(dá)STAT3后,乳腺癌細(xì)胞中EMT相關(guān)分子指標(biāo)的表達(dá)變化;采用免疫熒光染色進(jìn)一步觀察乳腺癌細(xì)胞中STAT3表達(dá)下調(diào)對(duì)EMT相關(guān)分子指標(biāo)的定位及表達(dá)的影響;采用transwell小室體外遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)及劃痕實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞降表達(dá)STAT3后其遷移和侵襲能力的變化;在免疫缺陷小鼠轉(zhuǎn)移模型中研究下調(diào)STAT3的表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響。11)運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)探究STAT3對(duì)Nanogp8轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控作用;采用Western blotting和transwell小室體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在下調(diào)Nanogp8的基礎(chǔ)上,再下調(diào)STAT3后乳腺癌細(xì)胞T47D中EMT相關(guān)分子指標(biāo)的變化及細(xì)胞侵襲能力的變化。12)通過免疫缺陷小鼠轉(zhuǎn)移模型來檢測(cè)乳腺癌T47D中同時(shí)下調(diào)Nanogp8和STAT3后,細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的變化。結(jié)果:1)通過核酸序列測(cè)序比對(duì),發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)的Nanog僅來源于其逆基因Nanogp8的編碼,而且和Nanog一樣屬于核定位。2)Nanogp8的蛋白表達(dá)水平在乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中顯著高于T47D和MDA-MB-231,后兩者中前者略高于后者;當(dāng)在乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中上調(diào)Nanogp8后,細(xì)胞形態(tài)由原來的長(zhǎng)梭形變?yōu)檫B接較為緊密的鵝卵石樣,即發(fā)生了顯著的間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化(mesenchymal-epithelial transition,MET),EMT相關(guān)分子指標(biāo)也發(fā)生了一致性的變化而且細(xì)胞的體外遷移和侵襲能力顯著降低。3)在T47D中降表達(dá)Nanogp8后細(xì)胞發(fā)生了明顯的EMT現(xiàn)象,且EMT相關(guān)分子指標(biāo)也發(fā)生了一致性的變化即E-cadherin表達(dá)顯著下降,間質(zhì)指標(biāo)Vimentin和Snail明顯升高而且細(xì)胞的體外遷移和侵襲能力也顯著增強(qiáng)。4)下調(diào)Nanogp8顯著增強(qiáng)了乳腺癌T47D細(xì)胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力。5)Nanogp8在Snail的啟動(dòng)子區(qū)存在結(jié)合位點(diǎn)且直接抑制Snail啟動(dòng)子活性。6)下調(diào)Snail的表達(dá)沒有顯著地逆轉(zhuǎn)由Nanogp8降表達(dá)引發(fā)的乳腺癌細(xì)胞EMT,細(xì)胞的體外侵襲能力也沒有十分明顯的減弱。7)Nanogp8在E-cadherin的啟動(dòng)子區(qū)存在結(jié)合位點(diǎn)且直接加強(qiáng)E-cadherin的啟動(dòng)子活性。8)STAT3在Nanogp8的啟動(dòng)子區(qū)存在結(jié)合位點(diǎn)且直接抑制Nanogp8的啟動(dòng)子活性。9)下調(diào)STAT3的表達(dá)后,乳腺癌細(xì)胞中Nanogp8的蛋白和m RAN表達(dá)水平明顯提高,而Nanog P8仍為核定位。10)在乳腺癌MDA-MB-231和T47D細(xì)胞中下調(diào)STAT3后,細(xì)胞均發(fā)生了MET現(xiàn)象,其EMT相關(guān)指標(biāo)均發(fā)生了一致性的變化,細(xì)胞遷移及侵襲能力顯著減弱,而且STAT3降表達(dá)明顯抑制了細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力。11)下調(diào)STAT3的表達(dá)顯著增強(qiáng)了Nanogp8的轉(zhuǎn)錄活性。STAT3的下調(diào)不能逆轉(zhuǎn)由Nanogp8下調(diào)引發(fā)的乳腺癌EMT。12)下調(diào)STAT3不影響Nanogp8穩(wěn)定降表達(dá)細(xì)胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力。結(jié)論:本課題組研究發(fā)現(xiàn)外源性高表達(dá)Nanogp8使乳腺癌細(xì)胞發(fā)生MET現(xiàn)象,而降表達(dá)Nanogp8明顯的促進(jìn)了乳腺癌EMT過程,同時(shí)也增強(qiáng)了乳腺癌細(xì)胞體外的遷移、侵襲能力和動(dòng)物體內(nèi)的轉(zhuǎn)移能力。而且,我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)Nanogp8負(fù)調(diào)控乳腺癌EMT過程是通過直接抑制轉(zhuǎn)錄因子Snail的啟動(dòng)子活性,這個(gè)轉(zhuǎn)錄因子是E-cadherin表達(dá)的重要抑制因子;或者通過直接抑制E-cadherin的啟動(dòng)子活性,而E-cadherin在腫瘤發(fā)生EMT過程中起到的“守門員”的作用。另外,我們證實(shí)STAT3通過直接抑制Nanogp8的啟動(dòng)子活性和轉(zhuǎn)錄活性來充當(dāng)上游調(diào)控因子,參與到Nanogp8負(fù)調(diào)控乳腺癌EMT的過程中。我們的研究揭示了一條新的存在于乳腺癌EMT及轉(zhuǎn)移過程中的信號(hào)通路即STAT3/Nanogp8/E-cadherin信號(hào)軸。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R737.9

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 ;鈣粘素E水平低提示乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[J];中國(guó)腫瘤;2000年08期

2 黃嘯原;用“印度閱兵”形容乳腺癌合適嗎?[J];診斷病理學(xué)雜志;2001年02期

3 張嘉慶,王殊,喬新民;乳腺癌的現(xiàn)狀和遠(yuǎn)景[J];中華外科雜志;2002年03期

4 張維彬,汪波,石靈春;中醫(yī)藥在現(xiàn)代乳腺癌治療中的運(yùn)用[J];中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合急救雜志;2002年01期

5 薛志勇;食物與乳腺癌[J];山東食品科技;2002年04期

6 王旬果,王建軍,鄭國(guó)華;乳腺癌相關(guān)標(biāo)志物的研究進(jìn)展[J];山東醫(yī)藥;2002年33期

7 陸尚聞;;男人也患乳腺癌[J];環(huán)境;2003年12期

8 ;新技術(shù)清晰拍攝早期乳腺癌細(xì)胞[J];上海生物醫(yī)學(xué)工程;2005年04期

9 田富國(guó);郭向陽(yáng);張華一;;乳腺癌診治研究新進(jìn)展[J];腫瘤研究與臨床;2005年S1期

10 馬濤,谷俊朝;血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子與乳腺癌的臨床研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(外科學(xué)分冊(cè));2005年01期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 于永利;;抗乳腺癌免疫治療融合蛋白[A];中國(guó)免疫學(xué)會(huì)第四屆學(xué)術(shù)大會(huì)會(huì)議議程及論文摘要集[C];2002年

2 郭紅飛;;中醫(yī)治療乳腺癌的策略[A];江西省中醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合腫瘤學(xué)術(shù)交流會(huì)論文集[C];2012年

3 龐朋沙;伍會(huì)健;;乳腺癌治療靶標(biāo)的研究進(jìn)展[A];北方遺傳資源的保護(hù)與利用研討會(huì)論文匯編[C];2010年

4 陸勁松;邵志敏;吳炅;韓企夏;沈鎮(zhèn)宙;;新型維甲酸抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制研究[A];2000全國(guó)腫瘤學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C];2000年

5 劉愛國(guó);胡冰;;乳腺癌臨床治療進(jìn)展[A];安徽省抗癌協(xié)會(huì)第四次代表大會(huì)暨乳腺癌、肺癌專業(yè)委員會(huì)成立會(huì)議、安徽省腫瘤防治進(jìn)展學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編[C];2001年

6 張嘉慶;王殊;喬新民;;乳腺癌的現(xiàn)狀和遠(yuǎn)景[A];第一屆全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合乳腺疾病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2002年

7 劉清俊;;乳腺癌綜合治療的新進(jìn)展[A];山西省抗癌協(xié)會(huì)第六屆腫瘤學(xué)術(shù)交流會(huì)論文匯編[C];2003年

8 邵志敏;;21世紀(jì)乳腺癌治療的展望[A];第三屆中國(guó)腫瘤學(xué)術(shù)大會(huì)教育論文集[C];2004年

9 陳松旺;張明;;乳腺癌治療的回顧與展望[A];西部地區(qū)腫瘤學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2004年

10 白霞;傅建新;丁凱陽(yáng);王兆鉞;阮長(zhǎng)耿;;組織因子途徑抑制物-2在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)研究[A];第10屆全國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)會(huì)議論文摘要匯編[C];2005年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 ;血檢有望揭示乳腺癌治療效果[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2004年

2 記者 鄭曉春;乳腺癌細(xì)胞擴(kuò)散基因被找到[N];科技日?qǐng)?bào);2007年

3 中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤中心主任 宋三泰;乳腺癌有了新療法[N];中國(guó)婦女報(bào);2002年

4 王艷紅;抑制ＤＮＡ修補(bǔ)可消滅乳腺癌細(xì)胞[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2005年

5 詹建;乳腺癌飲食 兩個(gè)時(shí)期不一樣[N];中國(guó)中醫(yī)藥報(bào);2006年

6 辛君;乳腺癌擴(kuò)散基因“浮出水面”[N];大眾衛(wèi)生報(bào);2009年

7 記者 毛黎;美發(fā)現(xiàn)有效抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的分子[N];科技日?qǐng)?bào);2010年

8 記者 吳春燕　通訊員 王麗霞;乳腺癌治療將有新途徑[N];光明日?qǐng)?bào);2011年

9 王樂　沈基飛;我科學(xué)家發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致乳腺癌耐藥的新標(biāo)志物[N];科技日?qǐng)?bào);2011年

10 劉霞;一種天然分子能阻止乳腺癌惡化[N];科技日?qǐng)?bào);2011年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 袁杰;STAT3調(diào)控Nanogp8 轉(zhuǎn)錄沉默促進(jìn)乳腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2017年

2 柴紅燕;疾病狀態(tài)下CYP4Z1和4A的生物學(xué)行為及其藥物干預(yù)研究[D];武漢大學(xué);2012年

3 李凱;ID(inhibitor of DNA binding)家族蛋白調(diào)控乳腺細(xì)胞的分化并影響乳腺癌的預(yù)后[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

4 江一舟;乳腺癌新輔助化療前后基因變異檢測(cè)及其功能論證[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

5 馬邵;酪氨酸去磷酸化增強(qiáng)表皮生長(zhǎng)因子受體在乳腺癌治療中靶向性的研究[D];山東大學(xué);2015年

6 姚若斯;精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶PRMT7誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生表皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)換及轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制研究[D];東北師范大學(xué);2015年

7 侯培鋒;α-酮戊二酸二甲酯(DM-2KG)上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)誘發(fā)高致瘤性干細(xì)胞樣乳腺癌細(xì)胞機(jī)制研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2014年

8 李麗麗;分泌蛋白SHON調(diào)控乳腺癌細(xì)胞EMT的分子機(jī)制研究[D];東北師范大學(xué);2015年

9 陳麗艷;PI3K抑制劑聯(lián)合組蛋白去乙�；敢种苿⿲�(duì)乳腺癌協(xié)同殺傷作用的分子機(jī)制研究[D];延邊大學(xué);2015年

10 樸俊杰;乳腺癌差異基因篩選及PAIP1對(duì)其生物學(xué)行為的影響[D];延邊大學(xué);2015年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 杜文英;乳腺癌分子亞型的臨床與病理特點(diǎn)[D];鄭州大學(xué);2011年

2 賈曉菲;彩色多普勒超聲與乳腺癌病理及免疫組化指標(biāo)的相關(guān)性研究[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2015年

3 靳文;乳腺癌全基因組DNA甲基化修飾的研究[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2015年

4 吳坤琳;TLR4/MyD88信號(hào)通路對(duì)乳腺癌侵襲性影響的實(shí)驗(yàn)研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

5 葛廣哲;樹，

本文編號(hào)：1627379