本文選題：肝細(xì)胞肝癌　切入點(diǎn)：外泌體　出處：《南京大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是臨床常見的惡性腫瘤之一,位列全球范圍腫瘤相關(guān)性死因第二位。HCC患者預(yù)后較差原因主要在于患者臨床診斷時(shí)病期已較晚,腫瘤出現(xiàn)肝內(nèi)或遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移。索拉非尼是目前唯一批準(zhǔn)用于HCC治療的多靶點(diǎn)藥物,HCC患者出現(xiàn)索拉菲尼抵抗也是影響其生存期的主要問題。既往研究發(fā)現(xiàn),外泌體作為多種不同類型細(xì)胞分泌的納米囊泡,可通過轉(zhuǎn)運(yùn)多種生物活性分子至靶細(xì)胞,參與腫瘤微環(huán)境的調(diào)控,進(jìn)而影響腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移及藥物抵抗等。此外,腫瘤細(xì)胞來源的外泌體攜帶其來源細(xì)胞特異性的蛋白、脂類和miRNA等,因而將外泌體作為多種腫瘤診斷的生物標(biāo)志物越來越受到人們重視。然而,目前關(guān)于不同侵襲特性HCC細(xì)胞來源的外泌體在HCC索拉菲尼抵抗以及EMT引起的腫瘤轉(zhuǎn)移方面的作用尚未見報(bào)道。此外,外泌體關(guān)鍵miRNA在HCC診斷以及腫瘤發(fā)展中的具體作用和機(jī)制報(bào)道較少。本研究以HCC細(xì)胞來源的外泌體為研究重點(diǎn),探討不同侵襲特性HCC細(xì)胞來源的外泌體在HCC索拉菲尼抵抗、侵襲轉(zhuǎn)移和臨床診斷中的潛在作用和具體分子機(jī)制。我們首先通過超速離心方法提取了不同侵襲特性HCC細(xì)胞培養(yǎng)上清內(nèi)的外泌體,并應(yīng)用TEM、western blot等方法進(jìn)行分析、鑒定。然后將受體HCC細(xì)胞與索拉菲尼及不同侵襲特性HCC細(xì)胞來源的外泌體共培養(yǎng),探討HCC細(xì)胞來源的外泌體與腫瘤細(xì)胞索拉菲尼抵抗的關(guān)系。我們發(fā)現(xiàn)不同侵襲特性HCC細(xì)胞來源的外泌體可在體內(nèi)和體外誘導(dǎo)HCC細(xì)胞索拉菲尼抵抗,且高侵襲HCC細(xì)胞來源的外泌體效果更強(qiáng)。HCC細(xì)胞來源的外泌體可能通過逆轉(zhuǎn)索拉菲尼引起的細(xì)胞凋亡以及激活HGF/c-Met/Akt通路,上調(diào)多種藥物抵抗相關(guān)蛋白發(fā)揮此作用。然后,我們研究了不同侵襲特性HCC細(xì)胞來源的外泌體在腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用和機(jī)制。我們通過細(xì)胞劃痕、Transwell等實(shí)驗(yàn)研究不同侵襲特性HCC細(xì)胞來源的外泌體對(duì)受體細(xì)胞遷移、侵襲能力以及細(xì)胞表型蛋白的影響。并進(jìn)一步通過應(yīng)用外源性TGF-β及其抑制劑LY2109761處理細(xì)胞后提取的外泌體驗(yàn)證以上作用。我們研究發(fā)現(xiàn),高侵襲特性的HCC細(xì)胞來源的外泌體可通過遞送其內(nèi)的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β)至受體HCC細(xì)胞影響其生長(zhǎng)微環(huán)境,驅(qū)動(dòng)其細(xì)胞表型變化,進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。最后,我們探討HCC細(xì)胞來源的外泌體內(nèi)其它關(guān)鍵分子如miRNA等在HCC進(jìn)展、臨床診斷和預(yù)后判斷中的作用。我們應(yīng)用miRNA芯片方法篩選不同侵襲特性HCC細(xì)胞來源的外泌體內(nèi)顯著差異表達(dá)的miRNA,根據(jù)設(shè)定的Cut-off值篩選出miR-665作為候選miRNA,其在HCC中未見報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)HCC患者血清外泌體miR-665水平較正常對(duì)照組明顯升高,且與HCC患者腫瘤大小、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移、臨床分期以及患者預(yù)后等臨床病理指標(biāo)密切相關(guān)。進(jìn)一步體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)研究提示,HCC細(xì)胞來源的外泌體可能通過miR-665激活MAPK/ERK通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖,應(yīng)用慢病毒轉(zhuǎn)染特異性敲低HCC細(xì)胞來源的外泌體miR-665后,效果較前明顯減弱。研究提示外泌體內(nèi)miR-665或可作為HCC診斷及預(yù)后判斷的有效標(biāo)志物。此外,我們還對(duì)HCC細(xì)胞來源的外泌體攜帶的蛋白進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)其含有與腫瘤細(xì)胞惡性增殖、血管新生密切相關(guān)的VEGFR等。綜上所述,我們的研究系統(tǒng)探討了不同侵襲特性HCC細(xì)胞來源的外泌體在HCC索拉菲尼抵抗、侵襲轉(zhuǎn)移以及臨床診斷、預(yù)后判斷中的作用和機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn),HCC細(xì)胞來源的外泌體可能通過轉(zhuǎn)運(yùn)其內(nèi)的多種生物分子(細(xì)胞因子、蛋白、miRNA等)影響受體細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和藥物抵抗等。且HCC細(xì)胞來源的外泌體根據(jù)其來源細(xì)胞侵襲特性不同,其內(nèi)成分存在表達(dá)差異。我們的研究揭示了 HCC來源的外泌體在腫瘤藥物抵抗和侵襲轉(zhuǎn)移中的作用和分子機(jī)制,對(duì)于開發(fā)針對(duì)外泌體及其內(nèi)生物分子的新型HCC診療手段提供幫助和理論支持。
[Abstract]:Hepatocellular carcinoma (Hepatocellular, carcinoma, HCC) is one of the most common malignant tumors, ranked second range of tumor death associated with prognosis in patients with.HCC. The reason mainly lies in the clinical diagnosis of patients with the disease when period is late, the tumor appeared in liver or distant organ metastasis. Sola Fini is currently the only approved for multiple target drug treated HCC. Sola Feeney resistance is also the main problem affecting the survival of HCC patients. Previous studies found that exosomes as many different types of cells secreting vesicles, can transport a variety of biologically active molecules to target cells, is involved in regulation of tumor microenvironment, thereby affecting tumor progression, metastasis and drug resistance. In addition, outside urinary body from tumor cells carrying its source cell specific proteins, lipids and miRNA, thus the exosomes as a diagnostic biomarker of tumor Material has attracted more and more attention. However, the exosomes on different invasiveness of HCC cells derived from HCC in sorafenib resistant and EMT induced tumor metastasis effect has not been reported. In addition, exosomes key miRNA reported specific role in the diagnosis of HCC and the development of the tumor and the mechanism in this study is less. Exosomes derived from HCC cells as the research focus, to explore the resistance of exosomes derived from HCC cells with different invasive characteristics in HCC Sola Feeney, the potential function and the molecular mechanism of invasion and metastasis and clinical diagnosis. We first extracted by ultracentrifugation method with different invasive characteristics of HCC cell culture supernatant in exosomes, and Application TEM, western, blot and other methods of analysis, identification. Then co cultured with exosomes HCC cell receptor and Sola Feeney and different invasion of HCC cells, HCC cells to investigate the source The relationship between exosomes and tumor cell Sola Feeney resistance. We found that exosomes derived from HCC cells with different invasive properties in vivo and in vitro can induce HCC cell apoptosis resistance Sola Feeney, exosomes and secreted high invasive HCC cells derived from.HCC cells derived from the body more likely to be caused by reverse Sola Feeney and activation HGF/c-Met/Akt pathway, multi drug resistance associated protein up to play this role. Then, we study the invasion of exosomes derived from HCC cells with different invasive characteristics in tumor cells, the effect and mechanism of metastasis. We by cell scratch, exosomes experimental study Transwell different invasiveness of HCC cells on the migration of receptor cells the invasion ability and influence, the cell phenotype protein. And further through the application of exogenous TGF- inhibitor and beta cells treated by LY2109761 extraction Exosomes. We verify the above findings, the high invasiveness of exosomes derived from HCC cells by transformation in the delivery of growth factors (TGF- beta) to HCC cell receptor influences the growth of micro environment, drive the cell phenotype change, thereby affecting the development and metastasis of tumor cells. Finally, we study progress of HCC cells in vivo excretion of other key molecules such as miRNA in HCC, the clinical diagnosis and prognosis of the role. The expression of secreted in vivo significantly we use miRNA chip screening method different invasion of HCC cells derived from miRNA, according to the set value of Cut-off miR-665 is selected as the candidate miRNA in the HCC there was no report. The study found that serum HCC exosome miR-665 level was obviously higher than normal control group, and HCC of patients with tumor size, metastasis, clinical stage and prognosis of patients with clinical pathology etc. The index is closely related. In vivo experiments, suggest that exosomes derived from HCC cells by miR-665 may activate the MAPK/ERK pathway to promote tumor cell proliferation, exosomes miR-665 transfected with lentivirus specific knockdown of HCC cells after effect significantly weakened. Studies suggest that miR-665 can be secreted in vivo or as an effective marker of HCC diagnosis and prognosis. In addition, we also exosomes on HCC cells carrying protein were analyzed, and found it had a malignant tumor cell proliferation, angiogenesis is closely related to the VEGFR. To sum up, our study system of resistance exosomes with different invasive characteristics of HCC cells in HCC Sola Feeney, invasion and metastasis, clinical diagnosis, effect and mechanism of prognosis. We found that exosomes derived from HCC cells through a variety of biological transport in the branch Sub (cytokines, protein, miRNA) receptor cell proliferation, metastasis and drug resistance. And the exosomes derived from HCC cells according to the characteristics of the different sources of cell invasion, the differential expression of the inner components. Our study reveals the exosomes derived from HCC resistance and the role and molecular mechanism of metastasis the invasion in cancer drug development, for the new HCC treatment means for foreign body and urinary in biological molecules to provide help and support the theory.

【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.7

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