本文選題：ALDH1A3　切入點(diǎn)：慢病毒　出處：《昆明醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：腦膠質(zhì)瘤是指起源于中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的腫瘤,除極少數(shù)低級(jí)別膠質(zhì)瘤(如毛細(xì)胞星形細(xì)胞瘤)患者可以通過外科手術(shù)治愈外,大部分惡性膠質(zhì)瘤患者盡管接受手術(shù)、放療和化療,仍難以避免復(fù)發(fā),給社會(huì)及患者家庭帶來巨大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和災(zāi)難性后果。對(duì)于腦膠質(zhì)瘤發(fā)病機(jī)制的研究已經(jīng)從組織病理水平逐漸深入到對(duì)腫瘤關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)基因和分子靶點(diǎn)進(jìn)行研究,其中主要包括了基因的變異、等位基因的雜合性缺失、腫瘤細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路失調(diào)以及腫瘤微環(huán)境改變等方面。經(jīng)典遺傳學(xué)說認(rèn)為,腫瘤是癌基因激活、抑癌基因失活的結(jié)果,代謝異常不過遺傳事件誘發(fā)腫瘤的伴隨現(xiàn)象。盡管人類基因組計(jì)劃、癌癥基因組圖譜使科學(xué)家們獲得了大量惡性膠質(zhì)瘤的遺傳學(xué)信息,然而惡性腫瘤的治療并沒有像預(yù)想中那樣取得突破性進(jìn)展。最近研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞能量代謝失控是惡性腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié),有氧糖酵解不是細(xì)胞癌變的結(jié)果,其本身就是一個(gè)癌性事件,這使很多研究者的目光重新聚焦到腫瘤代謝紊亂的研究上來,惡性腫瘤代謝異常有可能成為癌癥診斷和治療的新靶標(biāo)。近年來越來越多的證據(jù)顯示,很多癌基因或抑癌基因,都直接或間接參與代謝重編程,腫瘤代謝重編程一方面可以維持腫瘤細(xì)胞必須的能量供應(yīng),另一方面還可以促進(jìn)腫瘤增殖、侵襲所需要的生物大分子物質(zhì)的合成。不同腫瘤其代謝模式可能存在很大程度的差異,目前對(duì)于膠質(zhì)瘤代謝紊亂的認(rèn)識(shí)仍然停留在初級(jí)階段。因此,進(jìn)一步探索膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,為膠質(zhì)瘤治療尋找新的靶點(diǎn)是當(dāng)前神經(jīng)腫瘤科學(xué)研究迫切需要解決的問題。目前研究發(fā)現(xiàn)ALDH1A3是膠質(zhì)瘤干細(xì)胞生物標(biāo)志物,ALDH1A3的表達(dá)與ALDH的活性一致,只有敲低ALDH1A3而不是其他亞型,才能明顯降低ALDH的活性,ALDH1A3表達(dá)下降后可以明顯增加ALDH+惡性腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物(替莫唑胺、阿霉素和紫杉醇)的敏感性,ALDH1A3可能通過糖酵解途徑驅(qū)動(dòng)腫瘤的生長(zhǎng),抑制該酶可能會(huì)給高級(jí)別膠質(zhì)瘤的治療提供一個(gè)有前途的方法。然而,ALDH1A3調(diào)控的關(guān)鍵分子是什么,ALDH1A3是通過什么途徑參與膠質(zhì)瘤代謝重編程仍是懸而未決的問題。本研究為了闡述ALDH1A3在膠質(zhì)瘤中的作用機(jī)制及功能,通過焦磷酸測(cè)序檢測(cè)膠質(zhì)瘤組織ALDH1A3基因啟動(dòng)子甲基化情況,免疫組織化學(xué)及Western-Blot檢測(cè)ALDH1A3蛋白在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤組織及正常腦組織中的表達(dá)情況,實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87和U251中ALDH1A3的表達(dá),并分析ALDH1A3啟動(dòng)子甲基化與蛋白表達(dá)是否相關(guān)以及二者與患者預(yù)后之間的關(guān)系。隨后,采用慢病毒載體干擾技術(shù),敲低膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞中的ALDH1A3基因,建立裸鼠腦膠質(zhì)瘤原位移植模型,通過檢測(cè)細(xì)胞增殖能力、凋亡水平、細(xì)胞周期、線粒體膜電位、細(xì)胞內(nèi)ATP水平、葡萄糖消耗和糖酵解關(guān)鍵酶表達(dá),研究ALDH1A3下調(diào)后生物學(xué)功能改變的情況,進(jìn)一步通過高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,研究ALDH1A3基因下調(diào)后差異基因表達(dá),進(jìn)行生物信息學(xué)分析及驗(yàn)證。第一部分 膠質(zhì)瘤中ALDH1A3啟動(dòng)子甲基化及蛋白表達(dá)情況的鑒定目的:基因啟動(dòng)子甲基化被認(rèn)為是惡性腫瘤發(fā)生及演化中的重要表觀遺傳學(xué)調(diào)控手段,研究膠質(zhì)瘤組織中ALDH1A3基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與ALDH1A3蛋白表達(dá)相關(guān)性,并且探討ALDH1A3與膠質(zhì)瘤臨床病理關(guān)系及其在預(yù)后評(píng)估中的意義。方法:1.115例腦膠質(zhì)瘤臨床樣本及12例正常腦組織標(biāo)本來源于昆明醫(yī)科大學(xué)第二、第三附屬醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)切除標(biāo)本,依據(jù)2007年WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤病理分級(jí)獲得明確的膠質(zhì)瘤病理診斷,所有患者均進(jìn)行隨訪;2.應(yīng)用免疫組織化學(xué)法對(duì)115例膠質(zhì)瘤和12例正常腦組織的ALDH1A3表達(dá)情況與臨床病理因素關(guān)系進(jìn)行分析;3.分別選取低級(jí)別、高級(jí)別膠質(zhì)瘤樣本和正常腦組織樣本各2例,通過Western-Blot檢測(cè)膠質(zhì)瘤組織中ALDH1A3蛋白的表達(dá);4.通過焦磷酸測(cè)序?qū)?15例膠質(zhì)瘤標(biāo)本和12例正常腦組織進(jìn)行ALDH1A3啟動(dòng)子甲基化檢測(cè),分析甲基化狀態(tài)與臨床病理學(xué)因素的關(guān)系,并進(jìn)行生存分析,研究ALDH1A3表達(dá)與患者預(yù)后關(guān)系。5.體外培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251和U87,進(jìn)行細(xì)胞免疫組化研究ALDH1A3在膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251和U87中表達(dá),提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,通過qPCR檢測(cè)ALDH1A3相對(duì)表達(dá)量,為慢病毒干擾實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。結(jié)果:1. ALDH1A3在膠質(zhì)瘤中高表達(dá)我們通過焦磷酸測(cè)序檢測(cè)檢測(cè)115例膠質(zhì)瘤組織和12例正常腦組織的ALDH1A3啟動(dòng)子甲基化狀態(tài),結(jié)果發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤組織中ALDH1A3甲基化水平(36/115,31.3%),與正常腦組織(1/12, 8.3%)相比,膠質(zhì)瘤組織中ALDH1A3水平增高(p0.001);通過免疫組織化學(xué)方法研究ALDH1A3的表達(dá)和亞細(xì)胞定位,結(jié)果發(fā)現(xiàn)115例膠質(zhì)瘤標(biāo)本和12例正常腦組織標(biāo)本中,ALDH1A3主要表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿中,在膠質(zhì)瘤組織中的陽性率(79/115, 68.7%),較正常腦組織陽性率(1/12,8.3%)增高(p0.001),ALDH1A3啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與蛋白表達(dá)負(fù)相關(guān)。2.ALDH1A3在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)與病理分級(jí)呈正相關(guān),與患者的年齡、性別不相關(guān),ALDH1A3表達(dá)是膠質(zhì)瘤獨(dú)立預(yù)后因素。3.膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞和U251細(xì)胞中均有ALDH1A3表達(dá),主要定位于細(xì)胞漿和細(xì)胞膜,qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)U87細(xì)胞中ALDH1A3 mRNA表達(dá)量比U251細(xì)胞高。結(jié)論:1.膠質(zhì)瘤組織存在ALDH1A3啟動(dòng)子甲基化及ALDH1A3蛋白異常表達(dá),ALDH1A3啟動(dòng)子甲基化與蛋白表達(dá)負(fù)相關(guān),ALDH1A3表達(dá)水平隨膠質(zhì)瘤惡性級(jí)別的升高而增高,ALDH1A3啟動(dòng)子甲基化及ALDH1A3蛋白表達(dá)均可作為評(píng)價(jià)膠質(zhì)瘤級(jí)別的輔助指標(biāo)。2.膠質(zhì)瘤組織中ALDH1A3啟動(dòng)子甲基化及ALDH1A3蛋白表達(dá)與患者無進(jìn)展生存和總生存時(shí)間密切相關(guān),ALDH1A3啟動(dòng)子甲基化比非甲基化患者的無進(jìn)展生存和總生存時(shí)間延長(zhǎng);ALDH1A3蛋白表達(dá)陰性比陽性患者無進(jìn)展生存和總生存時(shí)間延長(zhǎng),提示ALDH1A3表達(dá)水平可作為患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)。3.ALDH1A3在U87和U251細(xì)胞中表達(dá)水平有差異,U87細(xì)胞為ALDH1A3相對(duì)高表達(dá)細(xì)胞株。第二部分ALDH1A3基因沉默對(duì)人腦膠質(zhì)瘤U87株生物學(xué)行為影響目的:通過慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù),下調(diào)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞株ALDH1A3基因的表達(dá),并研究ALDH1A3基因敲低后,細(xì)胞生物學(xué)行為及糖酵解關(guān)鍵酶的改變。方法:1.構(gòu)建ALDH1A3-shRNA及Scramble-shRNA (陰性對(duì)照組)慢病毒表達(dá)載體,測(cè)序鑒定、慢病毒包裝后轉(zhuǎn)染到U87細(xì)胞,用實(shí)時(shí)熒光定量和Western-blot檢測(cè)ALDH1A3干擾后mRNA和蛋白表達(dá),通過嘌呤霉素篩選穩(wěn)定干擾細(xì)胞株;2.穩(wěn)定干擾ALDH1A3表達(dá)后,CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖的變化,Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力變化,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期變化,JC1檢測(cè)線粒體細(xì)胞膜電位改變,ATP檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞內(nèi)APT含量,Glucose HK Assay試劑盒測(cè)定細(xì)胞葡萄糖消耗,Western-Blot檢測(cè)糖酵解關(guān)鍵酶PKM2及HK2的蛋白表達(dá)。3.將ALDH1A3-shRNA的U87細(xì)胞、陰性對(duì)照和空白對(duì)照U87細(xì)胞接種于裸鼠腦組織,進(jìn)行原位腦移植成瘤實(shí)驗(yàn),通過HE染色及Western-Blot檢測(cè)裸鼠腦內(nèi)成瘤及ALDH1A3表達(dá)情況,并通過生存分析研究ALDH1A3-shRNA對(duì)裸鼠總生存時(shí)間的影響。結(jié)果:1.重組慢病毒ALDH1A3-shRNA及Scramble-shRNA(陰性對(duì)照)測(cè)序結(jié)果正確,慢病毒成功包裝后轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞效率高。2.通過慢病毒轉(zhuǎn)染下調(diào)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞ALDH1A3表達(dá),可以發(fā)現(xiàn)以下生物學(xué)行為改變:ALDH1A3基因表達(dá)水平和蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著下降、細(xì)胞增殖下降、細(xì)胞凋亡增加、細(xì)胞周期阻滯于G2/M期、體外侵襲能力下降、線粒體膜電位JC-1下降、細(xì)胞內(nèi)ATP下降、葡萄糖消耗增高以及糖酵解代謝關(guān)鍵基因PKM2及HK2表達(dá)下調(diào)。3.與對(duì)照組相比,ALDH1A3-shRNA組裸鼠腦原位移植腫瘤體積縮小,HE染色顯示腫瘤細(xì)胞數(shù)量和核分裂相明顯減少,生存分析發(fā)現(xiàn)ALDH1A3-shRNA組裸鼠總生存時(shí)間延長(zhǎng),提示裸鼠腦膠質(zhì)瘤原位移植模型成功建立。結(jié)論:下調(diào)ALDH1A3基因的表達(dá),可以有效抑制細(xì)胞增殖和侵襲能力,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加、細(xì)胞周期G2/M期阻滯以及能量代謝的核心細(xì)胞器線粒體膜電位、細(xì)胞ATP水平下降,葡萄糖消耗增加以及糖酵解代謝相關(guān)基因PKM2及HK2表達(dá)下調(diào),這些結(jié)果提示ALDH1A3基因可能通過能量代謝、糖酵解代謝途徑參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。第三部分轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究ALDH1A3下調(diào)前后基因表達(dá)及生物信息學(xué)分析目的:通過高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析ALDH1A3-shRNA的U87細(xì)胞差異基因表達(dá),研究ALDH1A3基因在膠質(zhì)瘤中的作用。方法:構(gòu)建cDNA文庫后,應(yīng)用RNA-seq技術(shù)檢測(cè)沉默ALDH1A3基因前后的U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組中差異基因表達(dá),采用FPKM來估算樣本中的基因表達(dá)量,篩選基因表達(dá)差異倍數(shù)≥2的差異表達(dá)基因(DEGs)。應(yīng)用GO方法分析差異表達(dá)基因的功能聚類;應(yīng)用KEGG對(duì)差異基因涉及到的信號(hào)通路進(jìn)行富集分析;構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò),篩選差異表達(dá)基因網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵蛋白,通過Western-Blot方法進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果:U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞ALDH1 A3基因干擾前后的轉(zhuǎn)錄組共有104個(gè)差異表達(dá)基因,包括33個(gè)表達(dá)一致上調(diào)的基因、71個(gè)表達(dá)一致下調(diào)的基因,104個(gè)差異基因被分為24個(gè)功能聚類。我們通過KEGG信號(hào)通路分析,發(fā)現(xiàn)ALDH1A3干擾前后的差異表達(dá)基因富集到8條信號(hào)通路上(p0.05): (1)調(diào)節(jié)細(xì)胞侵襲;(2)凋亡信號(hào)通路;(3)FoxO信號(hào)通路;(4)糖酵解/糖原合成信號(hào)通路;(5)代謝相關(guān)信號(hào)通路;(6)Jack-STAT信號(hào)通路;(7)視黃醇代謝;(8)DNA剪切修復(fù)。根據(jù)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析的結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)4個(gè)重要差異表達(dá)基因:PKM2, STAT6,HSP90AB1, FoxO3。 在蛋白水平,利用 Western Blot 驗(yàn)證 PKM2, STAT6, FoxO3,HSP90AB1基因在U87細(xì)胞中的表達(dá),我們的研究發(fā)現(xiàn)PKM2, HSP90AB1和STAT6基因在ALDH1A3-shRNA膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞中表達(dá)較空白對(duì)照和陰性對(duì)照組降低(p0.01),FoxO3基因在在ALDH1A3-shRNA膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞中表達(dá)水平較空白對(duì)照和陰性對(duì)照組升高(p0.01)。結(jié)論:本研究首次利用RNA-seq技術(shù)對(duì)ALDH1A3-shRNA膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞中的差異表達(dá)基因進(jìn)行了全面分析,發(fā)現(xiàn)共有104個(gè)差異表達(dá)基因,包括33個(gè)表達(dá)一致上調(diào)的基因、71個(gè)表達(dá)一致下調(diào)的基因,主要富集到8條信號(hào)通路上,通過蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析顯示PKM2,HSP90AB1,FoxO3,STAT6基因起重要作用,其在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R739.41

【參考文獻(xiàn)】

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1 王明慧;馮林;李萍;韓^黶，

本文編號(hào)：1617823