發(fā)布時間：2018-03-16 02:02

  本文選題：IL-21　切入點：CIK細胞　出處：《蘭州大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:觀察IL-21對CIK細胞增殖、分泌、細胞亞群比例、細胞因子mRNA量表達的變化,探討IL-21對CIK細胞抗白血病系K562細胞毒性作用及其機制的影響。方法:抽取健康志愿者肝素抗凝的外周全血30ml,用Ficoll溶液提取出外周血單個核細胞,將該細胞置于3個不同的無菌培養(yǎng)瓶中,隨機設(shè)為對照組(加入IL-2 100ng/ml,無IL-21)、IL-21組(加IL-21,不加IL-2)、IL-21+IL-2組(加IL-21與IL-2),用含有10%FBS 1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng),每天在倒置相位差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化,第0、7、10、14d用手工計數(shù)法計數(shù)細胞數(shù)量及計算出總數(shù)量;第14d分別收取每組培養(yǎng)瓶中的懸液,離心,取上清液,用ELISA法測定上清中IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-10、TGF-β、IL-21量,收取細胞,用流式細胞術(shù)檢測CIK細胞亞群CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+、CD25+、CD4+CD25+比例,用CCK-8檢測CIK細胞對白血病系K562細胞的毒性作用,用實時熒光定量PCR法檢測穿孔素、Granzyme A、Granzyme B、Fasl、NKG2D、IL-21R mRNA表達量的變化,用Western blot法檢測CIK細胞JAK-STAT中STAT1、STAT5a、TAT3和STAT5b信號通路的變化。結(jié)果:CIK細胞培養(yǎng)至第5天開始,細胞體積略有增大,數(shù)量逐漸增多,第7、10d細胞數(shù)量明顯增多,IL-21組、IL-21+IL-2組細胞數(shù)量變化較對照組無明顯差異(P0.05),第14d細胞體積明顯較大,數(shù)量顯著增加,IL-21組細胞數(shù)量明顯低于對照組,有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),IL-21+IL-2組較對照組無明顯差異,無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);CIK細胞培養(yǎng)至第14天時,IL-21組、IL-21+IL-2組上清液中IFN-γ、TNF-α、IL-21量較對照組明顯升高,有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),IL-21組、IL-21+IL-2組IL-10量較對照組明顯降低,有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),IL-21組、IL-21+IL-2組較對照組IL-2、TGF-β量無明顯變化,無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);IL-21組、IL-21+IL-2組細胞亞群CD25+、CD3+CD4+、CD3+CD56+比例較對照組增加,有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),IL-21組、IL-21+IL-2組CD3+CD8+、CD4+CD25+比例較對照組無明顯變化,無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);IL-21組、IL-21+IL-2組CIK細胞對K562細胞的毒性明較對照組明顯增強,有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);IL-21組、IL-21+IL-2組CIK細胞穿孔素、顆粒酶B、Fasl、IL-2R、IL-21R mRNA量表達較對照組明顯升高,有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),IL-21組、IL-21+IL-2組顆粒酶A、NKG2DmRNA量表達較對照組無明顯變化,無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);Western blot的結(jié)果顯示,IL-21組、IL-21+IL-2組的STAT3和STAT5b表達較對照組明顯升高,IL-21組、IL-21+IL-2組、對照組STAT1和STAT5a的表達無明顯差異,此結(jié)果說明IL-21可以活化CIK細胞的STAT3和STAT5b信號通路。結(jié)論:IL-21誘導(dǎo)CIK細胞,無促進增殖的作用,但可增加CD25+、CD3+CD4+、CD3+CD56+亞群比例,促進分泌IFN-γ、TNF-α、IL-21,抑制分泌IL-10,促進細胞穿孔素、顆粒酶B、Fasl、IL-2R、IL-21R mRNA量表達,從而促進IL-21誘導(dǎo)CIK細胞對白血病系K562細胞的毒性作用,其機制之一是激活JAK-STAT中的STAT3、STAT5b細胞信號通路。
[Abstract]:Objective: to observe the effects of IL-21 on the proliferation, secretion, cell subgroup ratio and the expression of cytokine mRNA in CIK cells. To investigate the effect of IL-21 on the cytotoxicity of CIK cell line K562 and its mechanism. Methods: the peripheral blood 30 ml of heparin anticoagulant was extracted from healthy volunteers and the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were extracted with Ficoll solution. The cells were placed in three different aseptic culture flasks. The cells were randomly divided into control group (adding IL-2 100ng / ml, IL-21 + IL-21 + IL-21 + IL-21 + IL-21 + IL-21 + IL-21 and IL-2N), and cultured on the medium containing 10S1640. The cell morphology was observed under inverted phase difference microscope every day. On the 14th day, the cell number was counted by manual counting method and the total number was calculated. On the 14th day, the suspension from each culture bottle was collected, centrifuged, and supernatant was taken. The ELISA assay was used to determine the amount of IL-21 in the supernatant of IFN- 緯 -TNF- 偽 and IL-10 TGF- 尾 -tGF- 尾, and the percentage of CD4 / CD25 in CD3 CD4 CD3 CD8 CD3 CD56 CD25 / CD25 and CIK cells were detected by flow cytometry, and the toxicity of CIK cells to K562 cells was detected by CCK-8. Real time fluorescence quantitative PCR was used to detect the changes of IL-21R mRNA expression in CIK cells, and Western blot assay was used to detect the changes of STAT1, STAT5a, TAT3 and STAT5b signaling pathways in JAK-STAT. The number of cells in IL-21 IL-2 group was significantly increased on the 7th day (P 0.05), but the cell volume of IL-21 IL-2 group was significantly larger than that of the control group on the 14th day, and the number of IL-21 group was significantly lower than that of the control group, and the cell number of IL-21 group was significantly lower than that of the control group. There was no significant difference between the IL-2 group and the control group, and the content of IFN- 緯 -TNF- 偽 IL-21 in the supernatant of IL-21 IL-2 group was significantly higher than that in the control group at the 14th day, and the IL-10 content in the IL-21 IL-2 group was significantly lower than that in the control group. There was no significant change in the level of IL-21 IL-2 in IL-21 group compared with that in control group, and there was no significant difference in the percentage of CD3 CD4 CD3 CD56 in IL-21 IL-2 group compared with the control group, and there was no significant difference between P0.05 and IL-21 group in the percentage of CD25 CD3 CD4 and CD3 CD56 in IL-21 IL-2 group. The ratio of CD3 CD8 CD8 CD4 CD25 in IL-21 IL-2 group was not significantly different from that in control group, and the cytotoxicity of CIK cells to K562 cells in IL-21 IL-2 group was significantly higher than that in control group. Compared with the control group, the expression of IL-21R mRNA in the granzyme BsFasl1 + IL-2Rnr was significantly higher than that in the control group. There was no significant change in the expression of granzyme ANGG2D mRNA in the IL-21 IL-2 group compared with the control group, and the expression of IL-21R mRNA in the IL-21 IL-2 group was significantly higher than that in the control group. The expression of STAT3 and STAT5b in IL-21 IL-2 group was significantly higher than that in IL-21 IL-2 group, while the expression of STAT1 and STAT5a in IL-21 IL-2 group was not significantly higher than that in IL-21 IL-2 group. These results suggest that IL-21 can activate the STAT3 and STAT5b signaling pathways of CIK cells. Conclusion: IL-21 can induce the proliferation of CIK cells without promoting the proliferation of CIK cells, but it can increase the proportion of CD25 CD3 CD4 and CD3 CD56 subsets, promote the secretion of IFN- 緯 TNF- 偽 -IL-21, inhibit the secretion of IL-10, and promote the production of perforin. The expression of IL-2RnIL-21R mRNA in leukemic K562 cells induced by IL-21 could be enhanced by the activation of STAT3 / STAT5b signaling pathway in JAK-STAT.
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R733.7

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本文編號：1617812