本文選題：A549細(xì)胞株　切入點(diǎn)：A549/DDP細(xì)胞株　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:肺癌是目前世界上最常見的實(shí)體瘤之一,致死率高,順鉑作為臨床治療肺癌的基礎(chǔ)化療藥,由此產(chǎn)生的耐藥性是治療無效的主要原因之一,故而迫切需要尋找新的治療靶點(diǎn)以逆轉(zhuǎn)或者降低耐藥發(fā)生,進(jìn)而降低副作用發(fā)生率,提高患者生存率。外泌體(exosome)作為細(xì)胞間傳遞信號的囊泡結(jié)構(gòu),近年來隨著對其研究的深入,發(fā)現(xiàn)其在腫瘤發(fā)生、生長、侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥等方面發(fā)揮了舉足輕重的作用。本實(shí)驗(yàn)通過研究人肺腺癌順鉑耐藥株A549/DDP與野生株A549生物學(xué)行為,及耐藥株外泌體對同源細(xì)胞A549順鉑耐受性的影響,尋找可能的分子耐藥機(jī)制,從而獲得可能的耐藥靶點(diǎn)輔助治療。方法:1人肺腺癌順鉑耐藥株A549/DDP與野生株A549對順鉑的耐受性、細(xì)胞生長周期、細(xì)胞遷移特性的差異1.1購買人肺腺癌順鉑耐藥株A549/DDP,并且繼續(xù)誘導(dǎo)至其在順鉑(DDP)濃度2μg/ml中穩(wěn)定增殖。通過MTS實(shí)驗(yàn)檢測A549和A549/DDP細(xì)胞株對順鉑的IC50;用終濃度6μg/ml DDP處理A549細(xì)胞和A549/DDP細(xì)胞,PBS處理做對照,Annexin V-PE和7-AAD染色,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率,從以上兩方面分析A549/DDP細(xì)胞株與A549細(xì)胞株對順鉑的耐受性差異。1.2通過PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞生長周期,Western Blot檢測細(xì)胞蛋白p27表達(dá)變化,分析A549/DDP細(xì)胞株與A549細(xì)胞株細(xì)胞生長周期差異。1.3通過劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell縱向遷移實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移率;Western Blot檢測細(xì)胞株EMT相關(guān)蛋白(N-Cadherin,E-Cadherin,Vimentin)表達(dá),分析A549/DDP細(xì)胞株與A549細(xì)胞株遷移特性差異。2 A549/DDP細(xì)胞分泌的外泌體D-exo對同源細(xì)胞A549的順鉑耐受和遷移特性的影響2.1用含10%去外泌體胎牛血清(FBS)的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)A549與A549/DDP細(xì)胞株72h,收集上清,經(jīng)一系列差速離心后得到外泌體沉淀,沉淀用適量PBS溶解,測定蛋白含量以確定外泌體濃度,磷鎢酸負(fù)染,電鏡觀察外泌體形態(tài)。2.2熒光染料Dil標(biāo)記外泌體D-exo,與A549細(xì)胞株共培養(yǎng)過夜,觀察A549對D-exo的攝取。2.3用PBS、A549分泌的外泌體A-exo和A549/DDP分泌的外泌體D-exo(終濃度均為50μg/ml)分別預(yù)刺激A549細(xì)胞株72h后,MTS法檢測A549細(xì)胞株對順鉑的IC50;A549細(xì)胞株經(jīng)如上刺激后,加入終濃度6μg/ml的DDP作用48h,Annexin V-PE和7-AAD染色,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率,分析D-exo對A549細(xì)胞株順鉑耐受的影響。2.4經(jīng)2.3預(yù)刺激后,通過劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell縱向遷移實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移率,觀察D-exo對A549細(xì)胞遷移能力的影響。3 D-exo中miRNAs可誘導(dǎo)A549細(xì)胞對順鉑的抵抗3.1 Real-time PCR檢測細(xì)胞株miR-221-3p、miR-221-5p、miR-222-3p、miR-222-5p、miR-21-3p、miR-21-5p表達(dá)變化,篩選micro RNA研究對象。3.2 Real-time PCR檢測細(xì)胞株A549和A549/DDP及相應(yīng)外泌體A-exo、D-exo中miR-222-3p表達(dá)變化,比較其在外泌體與細(xì)胞的含量。3.3用PBS、A-exo和D-exo(終濃度均為50μg/ml)分別預(yù)刺激A549細(xì)胞株72 h后,Real-time PCR檢測A549細(xì)胞株miR-222-3p表達(dá)變化。3.4 Western Blot檢測A549和A549/DDP細(xì)胞株中miR-222-3p相關(guān)蛋白(PTEN,AKT,APE1)表達(dá)變化。用PBS、A-exo和D-exo(終濃度均為50μg/ml)分別預(yù)刺激A549細(xì)胞株72 h后,Western Blot檢測A549細(xì)胞株中PTEN、AKT表達(dá)變化,分析D-exo對同源細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果:1 A549與A549/DDP細(xì)胞株對順鉑的耐受性、細(xì)胞生長周期、細(xì)胞遷移特性的差異1.1確立A549/DDP耐藥株MTS法檢測A549細(xì)胞株對順鉑的IC50為8.37±1.82(μg/ml),A549/DDP細(xì)胞株對順鉑的IC50為63.71±16.87(μg/ml),耐藥指數(shù)為7.56±0.59,兩株細(xì)胞對順鉑的IC50有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示,A549細(xì)胞經(jīng)PBS和6μg/ml DDP分別處理48h后,凋亡率分別為6.37%±1.67%和38.44%±3.99%;A549/DDP細(xì)胞經(jīng)PBS,6μg/ml DDP分別處理48h后,凋亡率分別為6.84%±0.19%,20.86%±2.36%,A549細(xì)胞和A549/DDP細(xì)胞在6μg/ml DDP凋亡率有顯著差異(P0.01)。1.2 A549/DDP細(xì)胞增殖明顯減緩細(xì)胞周期結(jié)果顯示,A549/DDP細(xì)胞的G0/G1期的細(xì)胞數(shù)顯著高于A549細(xì)胞(P0.01),處于S期的細(xì)胞數(shù)顯著低于A549細(xì)胞(P0.01),G2/M期的細(xì)胞數(shù)高于A549細(xì)胞(P0.05)。A549/DDP增殖明顯減緩。Western Blot結(jié)果顯示A549/DDP細(xì)胞周期抑制蛋白P27較A549細(xì)胞明顯升高(P0.01)。1.3 A549/DDP細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,A549和A549/DDP細(xì)胞的遷移率分別為23.34%±6.86%和44.44%±6.41%,兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,遷移細(xì)胞經(jīng)結(jié)晶紫染色后計(jì)數(shù),A549細(xì)胞和A549/DDP細(xì)胞分別為26±7和198±22,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);染色細(xì)胞用冰乙酸抽提測吸光度結(jié)果顯示,A549細(xì)胞和A549/DDP細(xì)胞的吸光度分別是0.35±0.24和1.42±0.14,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。Western Blot結(jié)果表明,和A549細(xì)胞比較,A549/DDP細(xì)胞蛋白中神經(jīng)型鈣黏蛋白N-cadherin升高(P0.05),而上皮性鈣黏蛋白E-cadherin和波形蛋白Vimentin改變無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2 A549/DDP細(xì)胞分泌的外泌體D-exo對同源細(xì)胞A549的順鉑耐受、和遷移特性的影響2.1外泌體提取與鑒定利用差速離心方法得到A549細(xì)胞和A549/DDP細(xì)胞分泌的外泌體A-exo和D-exo,通過磷鎢酸負(fù)染在透射電子顯微鏡下觀察到大量散在的直徑約在40-100nm的橢圓形囊泡。2.2 A549細(xì)胞攝取外泌體將A549細(xì)胞與Dil熒光染料標(biāo)記的A549/DDP細(xì)胞分泌的外泌體D-exo共培養(yǎng)過夜,熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞內(nèi)存在大量紅色熒光,呈絲網(wǎng)狀。2.3 D-exo可增強(qiáng)A549細(xì)胞順鉑的耐藥性A549細(xì)胞分別經(jīng)PBS、A-exo、D-exo預(yù)刺激72h后,再加入6μg/ml順鉑處理48h,MTS檢測結(jié)果顯示,A549細(xì)胞對順鉑的IC50分別為8.37±1.82(μg/ml)、14.44±1.14(μg/ml)和39.44±8.46(μg/ml)。A-exo、D-exo均可顯著提高A549細(xì)胞對順鉑的耐受性(P0.05和P0.01),且D-exo提高A549細(xì)胞對順鉑的耐受性更明顯(P0.01)。細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示,A549分別與PBS、A-exo、D-exo共培養(yǎng),在順鉑濃度6μg/ml時(shí),凋亡率分別為48.44%±2.26%、40.58%±2.32%、28.06%±1.84%。與PBS和A-exo相比,D-exo可明顯增加A549對順鉑的抵抗(P0.05)。2.4 D-exo可促進(jìn)A549細(xì)胞遷移細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,PBS、A-exo、D-exo處理組A549細(xì)胞遷移率分別是25.68%±10.74%、33.57%±3.28%和55.0%±1.69%,與PBS和A-exo處理組相比,D-exo處理組A549細(xì)胞的遷移率明顯提高(P0.01)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,結(jié)晶紫染色A549遷移細(xì)胞并計(jì)數(shù),PBS、A-exo、D-exo處理組分別是27±8、67±14和139±13。經(jīng)冰乙酸抽提后吸光度值在PBS、A-exo、D-exo處理組分別是0.35±0.24、0.81±0.07和1.19±0.08,與PBS處理組相比,A-exo和D-exo處理組A549細(xì)胞遷移率均明顯提高(P0.05),且D-exo處理組比A-exo處理組促進(jìn)作用更明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3 D-exo中可誘導(dǎo)A549/DDP細(xì)胞對順鉑的抵抗的miRNAs3.1 A549/DDP細(xì)胞的miR-222-3p表達(dá)顯著上調(diào)實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,與A549細(xì)胞比較,A549/DDP細(xì)胞內(nèi)miR-222-3p相對表達(dá)量明顯增加,為10.79±1.72倍(P0.01),miR-221-3p、miR-221-5p、miR-21-5p相對表達(dá)水平也分別增加2.47±0.63、3.62±0.16、2.21±0.06倍,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.2 D-exo攜帶高水平的miR-222-3p實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,外泌體內(nèi)miR-222-3p表達(dá)高于同源細(xì)胞表達(dá)量,A-exo和D-exo表達(dá)量分別為同源細(xì)胞的2.28±0.34和3.29±0.39倍(P0.05)。3.3 D-exo可通過傳遞miR-222-3p增加A549細(xì)胞對順鉑的耐受實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,D-exo預(yù)刺激A549后miR-222-3p表達(dá)上調(diào),與PBS刺激組相比,A-exo和D-exo處理組miR-222-3p相對表達(dá)量分別為3.84±2.81(P0.05)和9.44±3.71倍(P0.01)。3.4 PTEN/AKT蛋白信號分子可能參與介導(dǎo)A549細(xì)胞對順鉑的抵抗作用Western Blot結(jié)果表明,和A549細(xì)胞比較,A549/DDP細(xì)胞中PTEN蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P0.01),p-AKT1蛋白顯著升高(P0.01),APE1蛋白無明顯差異。與PBS組和A-exo組相比,D-exo預(yù)刺激A549細(xì)胞后,明顯下調(diào)其PTEN蛋白表達(dá)(P0.01),進(jìn)而促進(jìn)p-AKT1的上調(diào)(P0.01)。結(jié)論:1 A549/DDP較A549細(xì)胞增殖減緩,遷移能力提高。2 A549/DDP細(xì)胞分泌的外泌體可促進(jìn)A549細(xì)胞的遷移、降低A549細(xì)胞對順鉑的敏感性。3 A549/DDP細(xì)胞株高水平表達(dá)miR-222-3p,并通過釋放富含miR-222-3p的外泌體促進(jìn)A549細(xì)胞對順鉑的抵抗。4 PTEN/AKT相關(guān)信號分子可能參與了A549/DDP細(xì)胞分泌的外泌體誘導(dǎo)的A549細(xì)胞對順鉑耐受性增加。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R734.2

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本文編號：1615774