本文選題：皮膚T細(xì)胞淋巴瘤　切入點(diǎn)：Hut78細(xì)胞　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:通過研究腺病毒介導(dǎo)的PTEN基因在體外培養(yǎng)的皮膚T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株Hut78細(xì)胞中有無抑制其增殖及促進(jìn)其凋亡的作用及其作用機(jī)制,以進(jìn)一步探討皮膚T細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)病機(jī)制及PTEN基因在皮膚T細(xì)胞淋巴瘤中的抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用機(jī)制,為開發(fā)皮膚T細(xì)胞淋巴瘤的新的治療方法提供理論依據(jù)。方法:1研究對(duì)象:人皮膚T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株Hut78購于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。人胚腎細(xì)胞株HEK293細(xì)胞由河北省四院腫瘤研究所保存,攜帶PTEN基因的腺病毒adenovirus-pten(ad-pten)及空白對(duì)照攜帶綠色熒光蛋白基因的腺病毒空載體adenovirus-gfp(ad-gfp)質(zhì)粒均購于加拿大Abm公司。2細(xì)胞的培養(yǎng):人皮膚T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株Hut78細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中,48-72h傳代1次,HEK293細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,24-48h傳代1次,置于37℃、5%CO_2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。3腺病毒的制備:攜帶PTEN、GFP基因的腺病毒質(zhì)粒ad-pten、ad-gfp轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞進(jìn)行腺病毒的擴(kuò)增、純化、滴度測定。4腺病毒感染率的分析:熒光顯微鏡下觀察攜帶綠色熒光蛋白的腺病毒ad-GFP感染Hut78細(xì)胞的效率。將對(duì)數(shù)生長期的Hut78細(xì)胞配成濃度為2×10~6/ml的單細(xì)胞懸液接種于六孔板(1ml/孔),以不同感染復(fù)數(shù)(MOI=1、10、50)的ad-GFP腺病毒感染細(xì)胞,培養(yǎng)24h、48h后分別于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。5感染腺病毒后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化:光學(xué)顯微鏡下觀察重組腺病毒ad-PTEN和ad-GFP分別以感染復(fù)數(shù)MOI=1、10、50感染Hut78細(xì)胞24h、48h后,細(xì)胞形態(tài)及生長狀態(tài)變化。6感染腺病毒后細(xì)胞增殖抑制情況分析:CCK-8法測定不同感染復(fù)數(shù)、不同感染時(shí)間的腺病毒ad-PTEN,ad-GFP對(duì)Hut78細(xì)胞株增殖的抑制率。將對(duì)數(shù)生長期的Hut78細(xì)胞配成濃度為2×10~2/μl的單細(xì)胞懸液接種于96孔板中,每孔50μl,ad-PTEN,ad-GFP腺病毒以感染復(fù)數(shù)MOI=1、10、50感染細(xì)胞,每孔50μl,并設(shè)空白孔(不含細(xì)胞的培基)和對(duì)照孔(未做感染的細(xì)胞),感染24、48h后,每孔加入10μl CCK-8,于37℃、5%CO_2的培養(yǎng)箱中孵育1-4h,酶標(biāo)儀測吸光度值(OD值),計(jì)算相應(yīng)的增殖抑制率,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。7感染腺病毒后細(xì)胞凋亡情況分析:流式細(xì)胞術(shù)法測細(xì)胞凋亡率。將對(duì)數(shù)生長期的Hut78細(xì)胞配成濃度為5×10~6/ml的單細(xì)胞懸液接種于6孔板中,每孔1ml,設(shè)空白對(duì)照組及ad-PTEN(MOI=1、10)感染組,感染24h后行流式細(xì)胞術(shù)。8 PTEN及下游信號(hào)通路蛋白的表達(dá):Western Blot法檢測PTEN蛋白及其下游信號(hào)通路蛋白PI3k,Akt,Caspase-3的表達(dá)情況。將對(duì)數(shù)生長期的Hut78細(xì)胞以5×10~6/ml的濃度接種于6孔板中,每孔1ml,以不同感染復(fù)數(shù)(MOI=1、10、50)的ad-PTEN感染細(xì)胞,并設(shè)對(duì)照孔(未做感染的細(xì)胞孔),培養(yǎng)48h后提取細(xì)胞的總蛋白,行Western Blot。結(jié)果:1腺病毒制備結(jié)果:經(jīng)過病毒的擴(kuò)增,純化,滴度測定,最終收獲的病毒滴度均是1×10~9pfu/ml;2腺病毒的感染效率:熒光顯微鏡下觀察重組腺病毒ad-GFP在Hut78細(xì)胞中的感染效率結(jié)果示感染效率隨感染復(fù)數(shù)的增高及感染時(shí)間的延長而增高,感染效率50(MOI)10(MOI)1(MOI),48h24h;3感染腺病毒后細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化:光學(xué)顯微鏡下觀察重組腺病毒ad-PTEN感染組的Hut78細(xì)胞隨著感染復(fù)數(shù)增高及感染時(shí)間的延長,細(xì)胞內(nèi)空泡、顆粒物的數(shù)量增多,部分細(xì)胞的核固縮、折光性變差,胞膜碎裂,細(xì)胞發(fā)生凋亡、死亡。而空白對(duì)照組及ad-GFP感染組細(xì)胞生長狀態(tài)及形態(tài)未發(fā)生明顯變化;4感染腺病毒后細(xì)胞增殖受抑制情況:導(dǎo)入PTEN基因后的Hut78細(xì)胞增殖受到抑制,抑制率隨感染復(fù)數(shù)的增高及感染時(shí)間的延長而增高。均感染24h后ad-PTEN組(MOI=0、1、10、50)組抑制率分別為0,(35.87±12.95)%,(58.53±16.71)%,(73.04±5.07)%,P0.01,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組內(nèi)比較除MOI=10組與MOI=50組之間P值0.05,差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義之外,其余各組內(nèi)P值均小于0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ad-GFP組(MOI=0、1、10、50)的抑制率分別為0、(4.83±0.84)%、(16.93±4.35)%、(21.87±5.72)%,P=0.39,差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且各組內(nèi)相互比較P值均大于0.05,差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。感染48h后ad-PTEN組(MOI=0、1、10、50)的增殖抑制率分別為0、(46.43±12.63)%、(64.28±13.40)%、(91.96±3.76)%,P0.01,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,組內(nèi)相互比較除MOI=1與MOI=50組間P0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其余各組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ad-GFP組(MOI=0、1、10、50)的抑制率分別為0、(18.98±5.28)%、(22.11±8.39)%、(20.31±1.56)%,P=0.20,差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且各組內(nèi)P值均大于0.05,差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;5感染腺病毒后細(xì)胞的凋亡情況:在空白對(duì)照組、重組腺病毒ad-PTEN感染組(MOI=1、10),Hut78早期凋亡率分別為6.5%、12.8%、18.2%,隨著感染復(fù)數(shù)的增高,細(xì)胞早期凋亡逐漸增多;6 PTEN及下游信號(hào)通路蛋白的表達(dá):在空白對(duì)照組、重組腺病毒ad-PTEN(MOI=1、10、50)組PI3k、Akt蛋白表達(dá)逐漸減弱,在空白對(duì)照組、MOI=1、10組PTEN蛋白、Caspase-3凋亡蛋白表達(dá)逐漸增強(qiáng),MOI=50組二者表達(dá)均較MOI=10組有所減弱。結(jié)論:1皮膚T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株可被腺病毒感染且感染效率隨腺病毒感染復(fù)數(shù)的增加及感染時(shí)間的延長而增加。2腺病毒導(dǎo)入的PTEN基因產(chǎn)生正常的PTEN蛋白使皮膚T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞發(fā)生明顯的形態(tài)學(xué)變化,誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡。3腺病毒導(dǎo)入的PTEN基因產(chǎn)生的正常PTEN蛋白抑制了皮膚T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的生長增殖能力。4腺病毒導(dǎo)入的PTEN基因產(chǎn)生的正常PTEN蛋白促使皮膚T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的早期凋亡增多。5腺病毒導(dǎo)入的PTEN基因產(chǎn)生的正常PTEN蛋白抑制了皮膚T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞中PI3k/Akt通路的磷酸化,從而促進(jìn)了Caspase-3凋亡信號(hào)誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡,提示我們PTEN基因可能通過該通路發(fā)揮了誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R739.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1615775