本文選題：HIF-1α　切入點：慢性髓細(xì)胞白血病　出處：《蘇州大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分缺氧狀態(tài)下HIF-1α對慢性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞增殖作用的研究目的本實驗通過采集慢性髓細(xì)胞白血病病人骨髓標(biāo)本和健康志愿者骨髓標(biāo)本,檢測HIF-1α的表達(dá)水平,了解病人骨髓中HIF-1αm RNA表達(dá)水平與健康志愿者間的差異。并嘗試分析HIF-1α基因?qū)β运杓?xì)胞白血病細(xì)胞增殖作用的影響和可能的作用機制。方法通過實時定量RT-PCR方法檢測慢性髓細(xì)胞白血病病人和相對正常病人骨髓標(biāo)本中HIF-1α的m RNA表達(dá)水平差異。通過RT-PCR法確認(rèn)K562細(xì)胞系中HIF-1α被Si RNA沉默。通過CCK-8法測定沉默HIF-1α后的K562細(xì)胞系的增殖和集落形成能力。通過RT-PCR法檢測沉默HIF-1α后的K562細(xì)胞系中p21、p53的m RNA水平,通過westernblot法檢測沉默HIF-1α后的K562細(xì)胞系中p21、p53蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果1慢性髓細(xì)胞白血病病人骨髓中HIF-1αm RNA的表達(dá)水平顯著高于對照組,存在顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2沉默K562細(xì)胞中的HIF-1α能顯著抑制K562細(xì)胞系的增殖能力,存在顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3沉默K562細(xì)胞中的HIF-1α能顯著抑制K562細(xì)胞系的集落形成能力,存在顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。4通過沉默K562細(xì)胞系的HIF-1α基因,該細(xì)胞系中p21的m RNA和蛋白表達(dá)被顯著抑制,而p53的m RNA和蛋白表達(dá)未受影響。結(jié)論1慢性髓細(xì)胞白血病病人骨髓中HIF-1α的表達(dá)水平顯著高于正常人。2 HIF-1α通過上調(diào)p21的表達(dá)可以促進(jìn)慢性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞的增殖。第二部分缺氧狀態(tài)下VEGF對慢性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞增殖作用的研究目的探討慢性髓細(xì)胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)患者血清中血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達(dá)水平及其對細(xì)胞增殖的影響。方法采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)定量檢測12例CML患者(7例慢性期,5例急變期)血清VEGF水平,體外高、低表達(dá)VEGF,利用RT-PCR法檢測VEGF轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞后VEGF m RNA水平,并觀察轉(zhuǎn)染后對K562細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果1血清VEGF在慢性髓細(xì)胞白血病患者組中的水平為115.8±32.72(ng/L),正常對照組的水平為391.95±91.21(ng/L),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。上述結(jié)果表明VEGF在CML患者組中表達(dá)較高。2檢測慢性髓細(xì)胞白血病不同臨床分期患者的血清VEGF水平,慢性髓細(xì)胞白血病慢性期患者的血清VEGF水平為267.4±58.89(ng/L),慢性髓細(xì)胞白血病急變期患者的血清VEGF水平為473±51.12(ng/L)。結(jié)果顯示慢性髓細(xì)胞白血病慢性期VEGF水平顯著低于急變期患者,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3與對照組相比,K562細(xì)胞轉(zhuǎn)染反義核苷酸后,VEGF m RNA水平顯著降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。同時反義核苷酸轉(zhuǎn)染入K562細(xì)胞后,隨著培養(yǎng)時間的延長,細(xì)胞增殖速度與對照組相比明顯減慢,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),而轉(zhuǎn)染正義核苷酸組,細(xì)胞生長速度與對照組比,無顯著性差異。提示了低表達(dá)VEGF表達(dá)水平可以抑制K562細(xì)胞的增殖。4在轉(zhuǎn)染反義核苷酸組的細(xì)胞中加入外源性的VEGF165后,能部分抵消反義核苷酸抑制K562細(xì)胞生長的作用,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。進(jìn)一步提示VEGF對細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用。結(jié)論1 VEGF能促進(jìn)慢性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞系K562細(xì)胞的增殖。2 VEGF能幫助監(jiān)測慢性髓細(xì)胞白血病的療效并預(yù)測預(yù)后。第三部分T315I突變的慢性髓細(xì)胞白血病協(xié)同治療的策略目的設(shè)計LBH589+ATO、LBH589+17-AAG、17-AAG+ATO、LBH589+Vx-680四個實驗組,將這四組藥物兩兩聯(lián)合分析其對Ba/F3-P210-T315I的治療效果并分析它們與單藥相比的協(xié)同效應(yīng)。方法采用CCK-8法檢測LBH589、ATO、17-AAG、Vx-680單藥及LBH589+ATO、LBH589+17-AAG、17-AAG+ATO、LBH589+Vx-680四組聯(lián)合用藥對Ba/F3-P210-T315I、Ba/F3-P210細(xì)胞系的增殖抑制作用。通過流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用AnnexinⅤ-PI試劑盒檢測單藥及聯(lián)合用藥對Ba/F3-P210-T315I、Ba/F3-P210細(xì)胞系的促凋亡作用。通過westernblot法檢測LBH589作用于Ba/F3-P210-T315I細(xì)胞系后Aurora激酶的表達(dá)水平。結(jié)果1 LBH589,ATO,17-AAG,Vx-680單獨使用對Ba/F3-P210-T315I細(xì)胞均有增殖抑制效應(yīng),但是Vx-680的增殖抑制效應(yīng)最為明顯,且抑制率隨著藥物濃度的增加成指數(shù)增長,ATO次之。但四種藥物的IC50濃度不同,分別為:LBH589(12 nmol/L),ATO(260 nmol/L),17-AAG(80 nmol/L),Vx-680(48 nmol/L)。2四種藥物對Ba/F3-P210細(xì)胞也具有增殖抑制效應(yīng),但是Vx-680的抑制效率最為明顯,且四種藥物的IC50濃度也不同,分別為:LBH589(24 nmol/L),ATO(480nmol/L),17-AAG(60 nmol/L),Vx-680(32 nmol/L)。3 LBH589+ATO、LBH589+17-AAG、17-AAG+ATO、LBH589+Vx-680四組聯(lián)合用藥對Ba/F3-P210-T315I細(xì)胞系的增殖抑制作用為隨著IC50濃度的增加,不同的藥物組合體現(xiàn)了不同的抑制效率,其中LBH589+Vx-680的組合增殖抑制作用最佳。4通過Annexin V-PI試劑盒染色及流式細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn),LBH589+Vx-680的促凋亡效率最為明顯,余次為LBH589+ATOATO+17-AAGLBH589+17-AAG。5 IC50濃度的LBH589作用于Ba/F3-P210-T315I細(xì)胞后Aurora A激酶的表達(dá)顯著減少,而Aurora B激酶的表達(dá)無明顯變化。結(jié)論1 LBH589、ATO、17-AAG、Vx-680單獨使用對Ba/F3-P210-T315I、Ba/F3-P210細(xì)胞均有增殖抑制效應(yīng)。2 LBH589+ATO、LBH589+17-AAG、17-AAG+ATO、LBH589+Vx-680四組聯(lián)合用藥中,LBH589+Vx-680對Ba/F3-P210-T315I細(xì)胞的增殖抑制和促凋亡效應(yīng)最好。3 LBH589+Vx-680對Ba/F3-P210-T315I細(xì)胞的增殖抑制和促凋亡效應(yīng)可能是通過抑制Aurora A激酶實現(xiàn)的。
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【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R733.7

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本文編號：1611543