本文選題：PAIP1　切入點：肝細(xì)胞癌　出處：《南昌大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:檢測肝癌組織及肝癌細(xì)胞株中PAIP1的表達水平,研究其在肝癌組織中的表達水平與肝癌患者的臨床病理特征參數(shù)之間的關(guān)系。觀察肝癌細(xì)胞株SMMC-7721中PAIP1基因的表達下調(diào)對肝癌細(xì)胞體內(nèi)外生物學(xué)行為的影響。初步探討PAIP1在肝細(xì)胞癌發(fā)生過程中的作用機制。方法:第一部分PAIP1在肝癌細(xì)胞及肝癌組織中的表達及臨床意義采用免疫組織化學(xué)方法檢測肝癌組織芯片PAIP1蛋白表達水平,比較肝癌組織和癌旁組織PAIP1的表達水平差異,分析肝癌組織中PAIP1的表達水平與肝癌患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系;運用實時熒光定量PCR(RT-PCR)技術(shù)觀察肝癌細(xì)胞株中的PAIP1 mRNA的表達水平。第二部分PAIP1的表達下調(diào)對肝癌細(xì)胞體內(nèi)外生物學(xué)行為的影響采用RNA干擾技術(shù)下調(diào)肝癌細(xì)胞株SMMC-7721中PAIP1的表達水平,研究PAIP1表達下調(diào)前后SMMC-7721細(xì)胞的生物學(xué)行為變化。Cellomics細(xì)胞計數(shù)檢測SMMC-7721細(xì)胞的增殖能力;流式細(xì)胞儀分析SMMC-7721細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡情況;克隆形成實驗觀察SMMC-7721細(xì)胞體外克隆形成能力;裸鼠成瘤模型探明SMMC-7721細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤的生長情況。第三部分PAIP1基因表達沉默后差異表達基因的篩選及驗證采用全基因組表達譜芯片篩選PAIP1表達敲減后的下游應(yīng)答基因,利用生物信息學(xué)方法,對應(yīng)答基因進行GO,Pathway分析,挑選出與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的關(guān)鍵基因進行Western blotting驗證。結(jié)果:第一部分PAIP1在肝癌細(xì)胞及肝癌組織中的表達及臨床意義在肝癌組織芯片中,PAIP1在肝癌組織中的表達水平顯著高于癌旁組織;PAIP1的表達水平與肝癌患者的性別、年齡、腫瘤大小及TNM分期等無明顯相關(guān)性,而與肝細(xì)胞癌的病理分級呈正相關(guān),并與病人生存率呈負(fù)相關(guān)。此外,PAIP1在肝癌細(xì)胞株中也呈高表達狀態(tài)。第二部分PAIP1的表達下調(diào)對肝癌細(xì)胞體內(nèi)外生物學(xué)行為的影響下調(diào)PAIP1的表達后,肝癌細(xì)胞增殖能力減弱;細(xì)胞凋亡增多;處于S期、G1期的細(xì)胞無顯著變化,處于G2期的細(xì)胞增多;細(xì)胞體外克隆形成能力減弱;裸鼠體內(nèi)成瘤能力減弱。第三部分PAIP1基因表達沉默后差異表達基因的篩選及驗證以FC2.0或FC0.5,P0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn),表達譜基因芯片結(jié)果顯示PAIP1敲減后SMMC-7721細(xì)胞內(nèi)基因發(fā)生改變的有333個,其中上調(diào)的有134個,下調(diào)的有199個。通過KEGG與BIOCARTA通路富集分析找到富集的差異基因所在的10條信號通路。Western blotting結(jié)果顯示PAIP1表達下調(diào)后與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的基因CCND1、CCND2、CDK6、MDM2的表達水平發(fā)生明顯變化。結(jié)論:(1)在肝癌組織及肝癌細(xì)胞株中PAIP1呈高表達狀態(tài),其可能在肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用。(2)PAIP1的表達下調(diào)可顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖,促進細(xì)胞的凋亡,抑制細(xì)胞的體外克隆形成,改變細(xì)胞周期的分布,抑制細(xì)胞的體內(nèi)成瘤。(3)PAIP1可能通過影響調(diào)控細(xì)胞周期的關(guān)鍵基因的表達從而在肝細(xì)胞癌發(fā)生過程中發(fā)揮促進作用。
[Abstract]:Objective: to detect the expression of PAIP1 in hepatocellular carcinoma tissues and hepatoma cell lines. To study the relationship between the expression of PAIP1 gene in HCC and the clinicopathological parameters of HCC patients, and to observe the effect of down-regulation of PAIP1 gene expression on the biological behavior of HCC cells in vivo and in vitro. Methods: the expression and clinical significance of PAIP1 in hepatocellular carcinoma cells and tissues were studied by immunohistochemical method. The expression of PAIP1 protein in hepatocellular carcinoma tissue was detected by immunohistochemical method. To compare the expression level of PAIP1 between HCC and paracancerous tissues, and to analyze the relationship between the expression of PAIP1 and the clinicopathological parameters of HCC. The expression level of PAIP1 mRNA in hepatoma cell line was observed by real-time fluorescence quantitative PCR- RT-PCR.The second part, the effect of down-regulation of PAIP1 expression on the biological behavior of hepatoma cell line in vivo and in vitro. The expression level of PAIP1 in SMMC-7721 cell line was down-regulated by RNA interference technique. To study the changes of biological behavior of SMMC-7721 cells before and after down-regulation of PAIP1 expression. The cell count of Cellomics was used to detect the proliferative ability of SMMC-7721 cells; flow cytometry was used to analyze the cell cycle and apoptosis of SMMC-7721 cells; clone formation assay was used to observe the cloning ability of SMMC-7721 cells in vitro. The growth of subcutaneous xenografts of SMMC-7721 cells in nude mice was investigated in nude mice. The third part was the screening and verification of differentially expressed genes after silencing of PAIP1 gene expression. Whole genome expression microarray was used to screen downstream response genes of PAIP1 expression after knockout. By using bioinformatics method, GOP Pathway was used to analyze the response gene. The key genes related to cell cycle regulation were selected for Western blotting verification. Results: the first part was the expression of PAIP1 in HCC cells and HCC tissues and its clinical significance in HCC tissue microarray. The expression level of PAIP1 in paracancerous tissues was significantly higher than that in patients with hepatocellular carcinoma. Age, tumor size and TNM stage were not significantly correlated, but were positively correlated with the pathological grade of HCC. In addition, the expression of PAIP1 was also highly expressed in hepatoma cells. The second part of the down-regulation of PAIP1 on the biological behavior of hepatoma cells in vivo and in vitro down-regulated the expression of PAIP1, the proliferation capacity of hepatoma cells decreased. The cell apoptosis increased, the cells in S phase and G 1 phase did not change significantly, and the cells in G 2 phase increased, and the ability of cell clone formation was weakened in vitro. The ability of tumorigenesis in nude mice was weakened. The screening and verification of differentially expressed genes after silence of PAIP1 gene expression in nude mice were based on FC2.0 or FC0.5. The results of gene microarray showed that there were 333 genes in SMMC-7721 cells after PAIP1 knockout. Of these, 134 were up-regulated. By enrichment analysis of KEGG and BIOCARTA pathway, we found 10 signal pathways in which the enriched differentially expressed genes were located. Western blotting results showed that the expression level of CCND1- CCND2CDK6MDM2 gene related to cell cycle regulation was obvious after down-regulation of PAIP1 expression. Conclusion the expression of PAIP1 in liver cancer tissue and hepatoma cell line is high. The down-regulation of PAIP1 may play an important role in the development of hepatocellular carcinoma (HCC). The down-regulation of PAIP1 can significantly inhibit the proliferation of hepatoma cells, promote cell apoptosis, inhibit cell clone formation in vitro, and change the distribution of cell cycle. Inhibition of tumorigenesis in vivo may play a promoting role in the carcinogenesis of hepatocellular carcinoma by affecting the expression of key genes that regulate cell cycle.
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

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