本文選題：miR-144　切入點(diǎn)：肺癌　出處：《鄭州大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景和目的原發(fā)性肺癌是目前世界上死亡率最高的腫瘤性疾病,按組織學(xué)分類可分為小細(xì)胞肺癌(SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)兩大類,后者的比例占到80%。肺癌預(yù)后不良,其5年生存率僅約為15%。近年來靶向治療成為肺癌研究最多的新的治療方案,因此進(jìn)一步研究肺癌的發(fā)生及發(fā)展、侵襲機(jī)制,探索新的基因治療靶點(diǎn)以用于肺癌的早期診斷和個(gè)體化治療,對(duì)攻克肺癌目前高死亡率的難題有著深遠(yuǎn)的意義。miRNAs通常是18~22nt長(zhǎng)的、內(nèi)源性、并且不編碼的RNA,它能夠與其靶基因的mRNA發(fā)生特異性結(jié)合從而影響其轉(zhuǎn)錄和翻譯功能。在人類等哺乳動(dòng)物當(dāng)中,miRNAs參與調(diào)控大約50%以上的基因蛋白的編碼活動(dòng)。miRNAs通常作用于mRNA 3’端和5’的非翻譯區(qū)(3’UTR區(qū),5’UTR區(qū)),通過與靶基因的seed region之間的結(jié)合與作用進(jìn)而發(fā)揮其調(diào)控功能。目前多數(shù)研究表明miRNAs參與各種生物過程的調(diào)控,并在其中起到非常重要的作用,其中包括衰老和一些疾病如惡性腫瘤等等的發(fā)展。miR-144最早被認(rèn)定為是由成熟的紅細(xì)胞系分化得來的。除此以外,miR-144可以通過直接調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)的中樞調(diào)節(jié)器官增加貧血的程度以及減少谷胱甘肽再生和抗氧化能力。在腫瘤研究中,一個(gè)關(guān)于miRNAs的表達(dá)的微陣列數(shù)據(jù)的meta分析提示:miR-144在肝癌細(xì)胞、肺癌和前列腺癌中呈低表達(dá)狀態(tài)。另有研究結(jié)果提示,上調(diào)miR-144的表達(dá)可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖。以上結(jié)果均表明,miR-144可能是一個(gè)與人癌癥相關(guān)的一個(gè)miRNA。但是,對(duì)于miR-144高表達(dá)在肺癌中的作用機(jī)制尚不明確,需要進(jìn)一步研究和探討。本研究計(jì)劃包含以下三部分:第一部分:肺癌組織中miR-144和TIGAR的表達(dá)情況及與肺癌患者臨床特征之間的相關(guān)性分析;第二部分:上調(diào)miR-144表達(dá)對(duì)肺癌H460和A549細(xì)胞株多種生物學(xué)的影響;第三部分:分析miR-144對(duì)TIGAR的初步調(diào)控機(jī)制。第一部分肺癌組織中miR-144和TIGAR表達(dá)水平及與患者臨床特征間的相關(guān)性的分析方法1.標(biāo)本收集:67例術(shù)后切除的肺癌及相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本。2.qRT-PCR技術(shù)用來檢測(cè)67例標(biāo)本中miR-144和TIGAR mRNA相對(duì)表達(dá)水平。3.Western-blot檢測(cè)各樣本中TIGAR蛋白相對(duì)表達(dá)量。4.分析miR-144和TIGAR mRNA的表達(dá)水平與肺癌患者的年齡、性別、吸煙與否、腫瘤大小、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期之間的相關(guān)性。5.應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以(x±s)表示;單因素方差分析用于同時(shí)具備正態(tài)性及方差齊性數(shù)據(jù)的多項(xiàng)指標(biāo)間的比較,LSD-t檢驗(yàn)用于多組數(shù)據(jù)的兩兩比較;t檢驗(yàn)用于兩獨(dú)立樣本計(jì)量資料的比較,配對(duì)t檢驗(yàn)用于兩配對(duì)樣本計(jì)量資料的比較;Pearson相關(guān)分析用來分析兩變量之間的相關(guān)性,設(shè)定檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。結(jié)果1.qRT-PCR檢測(cè)顯示miR-144的相對(duì)表達(dá)水平在肺癌組織中較癌旁組織顯著降低(P0.05),且和TIGAR mRNA的相對(duì)表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(R2=0.6627)。2.肺癌組織中miR-144的相對(duì)表達(dá)水平與患者的腫瘤大小、TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)(P0.05)。第二部分上調(diào)miR-144表達(dá)對(duì)肺癌H460和A549細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響方法1.制備、包裝p GV-miR-144慢病毒載體。2.慢病毒載體感染H460和A549細(xì)胞株,篩選出可以穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株,運(yùn)用qRT-PCR檢測(cè)慢病毒感染后H460和A549細(xì)胞中miR-144表達(dá)。3.按miR-144、miR-NC感染情況分別將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為miR-144組,Scramble組和Blank組。4.CCK-8、克隆形成實(shí)驗(yàn)用來檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力。5.流式細(xì)胞術(shù)、Caspase-3/7、Hoechst染色檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡能力。6.MDC染色檢測(cè)各組細(xì)胞的自噬能力。7.裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)上調(diào)miR-144的表達(dá)對(duì)肺癌A549裸鼠成瘤能力的影響。結(jié)果1.成功制備及包裝miR-144慢病毒載體,miR-144在感染的H460和A549細(xì)胞內(nèi)的相對(duì)表達(dá)量較Scramble組和Blank組顯著升高(P0.05)。2.CCK-8結(jié)果顯示miR-144組細(xì)胞吸光度較Scramble組和Blank組顯著減少�？寺⌒纬蓪�(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-144組較Scramble組和Blank組的細(xì)胞克隆形成數(shù)顯著降低,差異具有顯著性(P0.05)。3.流式細(xì)胞術(shù)和Hoechst染色檢測(cè)結(jié)果顯示miR-144組細(xì)胞凋亡百分比較Scramble組和Blank組顯著升高,miR-144組Caspase-3/7細(xì)胞活性較Scramble組和Blank組顯著升高,差異具有顯著性(P0.05)。4.MDC染色結(jié)果顯示miR-144組的細(xì)胞熒光強(qiáng)度較Scramble組和Blank組顯著升高(P0.05)。5.裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-144組的成瘤能力顯著低于Scramble組和Blank組(P0.05)。第三部分miR-144對(duì)TIGAR表達(dá)調(diào)控機(jī)制的初步研究方法1.運(yùn)用miRNA的靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫對(duì)miR-144的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。2.構(gòu)建pmir GLO-w-TIGAR、pmir GLO-mut-TIGAR重組載體。運(yùn)用雙報(bào)告基因驗(yàn)證miR-144的靶基因。3.構(gòu)建無3’UTR區(qū)的pc DNA3.1-TIGAR表達(dá)載體,回復(fù)實(shí)驗(yàn)分析miR-144對(duì)A549細(xì)胞生物學(xué)作用的調(diào)控。4.設(shè)計(jì)并合成siRNA序列可靶向作用于TIGAR,并分si-TIGAR組、miR-144組、Blank組轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞。運(yùn)用CCK-8法和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞增殖能力,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡能力,MDC染色檢測(cè)各組細(xì)胞的自噬能力,Western blotting檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果1.生物信息學(xué)軟件分析預(yù)測(cè)miR-144的靶基因可能為TIGAR2.雙報(bào)告基因結(jié)果表明,miR-144可以結(jié)合于TIGAR的3'UTR區(qū)發(fā)揮調(diào)控作用。3.miR-144對(duì)A549細(xì)胞的抑制增殖及促進(jìn)凋亡的能力可被轉(zhuǎn)染不含3’UTR區(qū)的pc DNA3.1-TIGAR重組載體后的A549細(xì)胞回復(fù)。4.A549細(xì)胞miR-144的表達(dá)上調(diào)及TIGAR表達(dá)下調(diào)均可抑制A549細(xì)胞的增殖、促進(jìn)其凋亡和自噬能力。結(jié)論1.miR-144在肺癌組織中的表達(dá)水平降低,且其表達(dá)水平與患者的腫瘤大小、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期有關(guān)。2.體外上調(diào)肺癌細(xì)胞中miR-144表達(dá)可抑制細(xì)胞的增殖能力,促進(jìn)細(xì)胞的凋亡和自噬能力。裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)表明上調(diào)miR-144的表達(dá)能有效抑制肺癌細(xì)胞的成瘤能力。3.miR-144可作用于TIGAR的3’UTR區(qū)負(fù)向調(diào)控其表達(dá),從而抑制肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、促進(jìn)細(xì)胞的凋亡和自噬,還能有效抑制肺癌細(xì)胞的成瘤能力。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R734.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1603696