本文選題：甲狀腺乳頭狀癌　切入點(diǎn)：靶標(biāo)代謝組學(xué)　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景：甲狀腺乳頭狀癌是甲狀腺癌最常見(jiàn)的病理類(lèi)型(約占80%),近年來(lái)世界各地均出現(xiàn)甲狀腺癌的發(fā)病率持續(xù)升高的現(xiàn)象,其中尤以甲狀腺乳頭狀癌發(fā)病率的上升最為明顯。研究表明,甲狀腺乳頭狀癌是一種“隋性”腫瘤,其早期診斷和及時(shí)的手術(shù)治療可以明顯改善患者預(yù)后,有效降低復(fù)發(fā)率和病死率。目前公認(rèn)的甲狀腺癌的診斷方法是超聲及超聲引導(dǎo)下細(xì)針穿刺活檢(FNAB),但是超聲診斷的缺陷在于其結(jié)果依賴于檢查者的個(gè)人技術(shù)水平,而FNAB的診斷靈敏度和特異性也并不盡人意,尤其是甲狀腺微小癌(癌灶直徑1cm)的FNAB陰性預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率只能達(dá)到72.2%。因此有很多研究者致力于找到有效的生物標(biāo)志物來(lái)輔助FNAB的診斷,提高甲狀腺癌術(shù)前診斷的準(zhǔn)確率,避免非必要的手術(shù)治療給患者帶來(lái)的焦慮情緒和身體創(chuàng)傷。代謝組學(xué)是一種利用分析化學(xué)方法來(lái)研究一個(gè)代謝物組中小分子代謝相關(guān)物質(zhì)及其變化規(guī)律的科學(xué)。它能夠及時(shí)而全面的分析出生物系統(tǒng)在某一特定階段存在的復(fù)雜的代謝物質(zhì),并能對(duì)這些物質(zhì)進(jìn)行定性以及定量的檢測(cè),反映內(nèi)外因變化對(duì)系統(tǒng)代謝造成的影響。目前它已成為一個(gè)公認(rèn)的系統(tǒng)分析平臺(tái),可用于組織、血液、尿液等生物樣本的研究,揭示其中小分子代謝物的組成特點(diǎn)及變化規(guī)律。根據(jù)研究模式不同,可將代謝組學(xué)分為非靶標(biāo)代謝組學(xué)和靶標(biāo)代謝組學(xué)。非靶標(biāo)代謝組學(xué)是從全局分析的角度將樣本中所有的代謝物質(zhì)識(shí)別出來(lái),該研究模式的優(yōu)勢(shì)在于全面尋找有差異的代謝物,可用于診斷標(biāo)志物的初步篩查；其缺點(diǎn)是對(duì)代謝物識(shí)別的準(zhǔn)確性不高,可信度較低,且只能進(jìn)行半定量測(cè)定。而靶標(biāo)代謝組學(xué)的特點(diǎn)則是利用相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)既定的一組代謝物質(zhì)進(jìn)行精確的定性定量分析,其準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性遠(yuǎn)高于非靶標(biāo)代謝組學(xué)。兩者互相結(jié)合可以各取所長(zhǎng),使得代謝組學(xué)研究結(jié)果更加完善。隨著生物信息技術(shù)的發(fā)展,越來(lái)越多的平臺(tái)被開(kāi)發(fā)出來(lái)用于代謝組學(xué)相關(guān)研究,包括氣相色譜-質(zhì)譜分析(GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜分析(LC-MS)和核磁共振譜學(xué)分析(NMR)等。因此筆者認(rèn)為代謝組學(xué)研究可以為尋找腫瘤標(biāo)志物及探索腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的代謝紊亂提供新的研究方向。研究目的：我們本次研究的目的是希望利用靶標(biāo)和非靶標(biāo)代謝組學(xué)相結(jié)合的方式探索甲狀腺乳頭狀癌的代謝特點(diǎn)。首先利用氣相色譜-飛行時(shí)間-質(zhì)譜(GC-TOF-MS)平臺(tái)找到針對(duì)甲狀腺乳頭狀癌組織進(jìn)行代謝組學(xué)分析的實(shí)驗(yàn)方法；其次通過(guò)非靶標(biāo)代謝組學(xué)的研究模式初步比較分析甲狀腺乳頭狀癌組織樣本和正常甲狀腺組織樣本,評(píng)價(jià)該方法的應(yīng)用效果,找到含量有差異的代謝物質(zhì)；進(jìn)而探索出利用超高效液相色譜-三重四級(jí)桿-質(zhì)譜(UHPLC-QqQ-MS) 和 GC-TOF-MS對(duì)肌醇半乳糖苷(galactinol)和蜜二糖(melibiose)等標(biāo)志物進(jìn)行測(cè)定的方法。最后通過(guò)靶標(biāo)代謝組學(xué)的模式進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),對(duì)篩選出的標(biāo)志物進(jìn)行精確定性和絕對(duì)定量分析,并根據(jù)定量結(jié)果分析標(biāo)志物的診斷價(jià)值,以期找到可用于輔助FNAB診斷的生物標(biāo)志物。從而提高甲狀腺乳頭狀癌的術(shù)前診斷準(zhǔn)確率,使患者能夠被早診斷早治療,同時(shí)減少患有非惡性甲狀腺結(jié)節(jié)患者的過(guò)度焦慮情緒,避免不必要的手術(shù)治療。此外,我們還可以通過(guò)對(duì)受影響的代謝通路的分析,研究甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制,探索其潛在的治療靶點(diǎn)。研究方法：1.臨床樣本的收集。甲狀腺乳頭狀癌及正常甲狀腺組織來(lái)源于甲狀腺手術(shù)患者(2013.12.1-2014.12.31,山東省立醫(yī)院乳腺甲狀腺外科)的術(shù)中樣本,共收集了50個(gè)樣本,其中包括25個(gè)術(shù)后病理證實(shí)為甲狀腺乳頭狀癌組織樣本和25個(gè)正常甲狀腺組織樣本。2. 非靶標(biāo)GC-TOF-MS代謝組學(xué)分析。共30個(gè)樣本(15個(gè)甲狀腺乳頭狀癌組織vs15個(gè)正常甲狀腺組織)用于非靶標(biāo)代謝組學(xué)分析。通過(guò)研磨,離心,提取等步驟,將組織中的代謝物質(zhì)分離,加入內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品L-2-氯苯丙氨酸后放入GC分析儀。GC分析柱中可將各組分根據(jù)分子量不同進(jìn)行分離,分離出的物質(zhì)依次進(jìn)入TOF-MS進(jìn)行各組分的質(zhì)量(mass)和保留時(shí)間(R.T.)測(cè)定。將數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫(kù)中的代謝物信息進(jìn)行比對(duì),得出代謝物的定性及半定量結(jié)果。3. 非靶標(biāo)GC-TOF-MS統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。原始數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)缺失值模擬,最小值二分之一法進(jìn)行填補(bǔ),數(shù)據(jù)過(guò)濾去噪,內(nèi)標(biāo)歸一法處理后導(dǎo)入SIMCA-P+ 13.0軟件進(jìn)行模式識(shí)別分析。模式識(shí)別分析方式包括主成分分析法(PCA)、偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA),另外為評(píng)估PLS-DA模型的穩(wěn)定性和預(yù)測(cè)能力我們進(jìn)行了7折交叉驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。最后基于OPLS-DA模型,進(jìn)行差異代謝物分析,篩選標(biāo)準(zhǔn)是變量投影重要性(VIP)大于1.0且t檢驗(yàn)結(jié)果P值0.05。用于代謝物相關(guān)通路分析的數(shù)據(jù)庫(kù)是京都基因和基因組百科全書(shū)(EGG; http://www.genome.jp/kegg/)。4.靶標(biāo)UHPLC-QqQ-MS分析和數(shù)據(jù)處理。共有20個(gè)樣本(10個(gè)甲狀腺乳頭狀癌組織vs 10個(gè)正常甲狀腺組織)用于靶標(biāo)分析。所有的分析物標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)過(guò)甲醇或蒸餾水稀釋配成具有濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 ng/μl至100 ng/μl)。進(jìn)入多反應(yīng)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)(MRM)的模式(陽(yáng)離子模式或陰離子模式),優(yōu)化參數(shù)去簇電壓(DP),碰撞能(CE)和碰撞通道輸出加壓值(CXP)的檢測(cè)值,選擇代謝物質(zhì)譜檢測(cè)響應(yīng)值最高的參數(shù)模式。樣本經(jīng)過(guò)預(yù)處理后進(jìn)入U(xiǎn)HPLC分析儀進(jìn)行色譜分析,然后進(jìn)入QqQ-MS得到最終結(jié)果。根據(jù)梯度標(biāo)準(zhǔn)品溶液測(cè)定結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,確定定量結(jié)果。T檢驗(yàn)用來(lái)分析兩組間某一代謝物的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,另外利用R語(yǔ)言軟件繪制受試者工作曲線(ROC curve)來(lái)評(píng)價(jià)各個(gè)獨(dú)立的生物標(biāo)志物和多個(gè)標(biāo)志物聯(lián)合的診斷效果。5.靶標(biāo)GC-TOF-MS分析和數(shù)據(jù)處理。所有的分析物標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)過(guò)甲醇或蒸餾水稀釋配成具有濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 ng/μl100 ng/μl)。與靶標(biāo)UHPLC-QqQ-MS分析同樣樣本共20個(gè)(10個(gè)甲狀腺乳頭狀癌組織vs 10個(gè)正常甲狀腺組織),經(jīng)過(guò)預(yù)處理(過(guò)程與非靶標(biāo)分析一樣)包括衍生化過(guò)程,進(jìn)入GC分析儀,然后進(jìn)入與之偶聯(lián)的TOF-MS。將待測(cè)物相關(guān)參數(shù)與相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比對(duì),得到最終的定量結(jié)果。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析過(guò)程與UHPLC-QqQ-MS相同。結(jié)果：1.我們探索出利用GC-TOF-MS技術(shù)平臺(tái)對(duì)甲狀腺乳頭狀癌組織樣本進(jìn)行分析的具體實(shí)驗(yàn)方法,彌補(bǔ)了之前沒(méi)有用這一平臺(tái)進(jìn)行甲狀腺癌組織樣本研究的不足。通過(guò)非靶標(biāo)的GC-TOF-MS分析得到全部樣本的代謝圖譜分析結(jié)果�；谏V分析過(guò)程,我們得到所有樣本的總離子色譜圖(TICs),圖中的各個(gè)色譜峰沒(méi)有漂移現(xiàn)象證明了各組分在色譜柱中保留時(shí)間的穩(wěn)定性。全部樣本分析后,共有761個(gè)色譜峰被識(shí)別出來(lái),去除噪音數(shù)據(jù)后最終得到686個(gè)代謝物信息。2.統(tǒng)計(jì)學(xué)模式識(shí)別分析發(fā)現(xiàn)GC-TOF-MS可以將甲狀腺乳頭狀癌樣本和正常甲狀腺組織樣本區(qū)別開(kāi)。首先,PCA計(jì)算的結(jié)果是R2X=0.427、Q2=0.159,PCA得分圖結(jié)果表明所有的樣本都可以被清晰地區(qū)分,且無(wú)不相關(guān)的離群樣本。其次,針對(duì)某些樣本沒(méi)能被清楚分組的情況,我們采取有監(jiān)督的方式對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,PLS-DA模型計(jì)算的結(jié)果是R2X=0.225和R2Y=0.944,證明了該模型中數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和模型參數(shù)的高度適應(yīng)性,得分圖顯示出兩組樣本區(qū)分明顯。同時(shí)對(duì)PLS-DA模型進(jìn)行7折交叉排列驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),結(jié)果排除了該模型中數(shù)據(jù)的隨機(jī)效應(yīng)。最后,我們用OPLS-DA模型將癌組織組和正常組精確區(qū)分開(kāi)來(lái),結(jié)果R2X=0.225, R2Y=0.944, Q2Y= 0.687,這表明該組數(shù)據(jù)的差別主要來(lái)自組間的差異。3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)組間含量有差異的代謝物共45個(gè),與之相關(guān)的受疾病影響的代謝通路有15個(gè)�；贠PLS-DA模型,我們篩選癌組織組和正常組之間含量有差異的代謝物,標(biāo)準(zhǔn)是VIP值1且P值0.05。差異倍數(shù)較明顯的代謝物包括α-氨基乙二酸(alpha-aminoadipic acid;差異倍數(shù)(FC)=20.05),α-亞麻酸(a-linolenic acid; FC=4.176)等。通過(guò)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)匹配到的受影響的代謝通路中,半乳糖代謝(Galactose metabolism)是受影響最大的代謝通路,其包含的差異代謝物數(shù)量最多,包括葡萄糖(Glucose).山梨醇(Sorbito 1).肌醇半乳糖苷(Galactinol)和蜜二糖(Melibiose)。其他受影響的代謝通路還包括賴氨酸降解(Lysine degradation),配體受體神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)通路(Neuroactive ligand-receptor interaction),嘧啶代謝(Pyrimidine metabolism),不飽和脂肪酸的合成(Biosynthesis of unsaturated fatty acids)以及雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(Two-component system)。參與這些通路的差異代謝物包括油酸(Oleic acid)、去甲腎上腺素(Noradrenaline)、花生酸(Arachidic acid)、α-氨基乙二酸(alpha-Aminoadipic acid)、戊二酸(Glutaric acid)、α-α-亞麻酸(Linolenic acid)、尿甘(Uridine)、5,6-二氫尿嘧啶(5,6-Dihydrouracil)和褪黑素(Melatonin)共9個(gè)。與半乳糖代謝通路中的4個(gè)代謝物結(jié)合起來(lái)共13個(gè)代謝物進(jìn)入后續(xù)靶標(biāo)代謝組學(xué)研究。4.靶標(biāo)代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證出11個(gè)代謝物質(zhì),經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,其中3個(gè)可作為潛在診斷標(biāo)志物。我們構(gòu)建了標(biāo)準(zhǔn)曲線用于待驗(yàn)證代謝物質(zhì)的定量分析,除glucose, glutaric acid 和 noradrenaline以外,其它的標(biāo)準(zhǔn)曲線的參數(shù)R2均大于0.98。除去noradrenaline 和 5,6-dihydrouracil以外,共有11個(gè)代謝物質(zhì)在樣本中得到驗(yàn)證,即它們具有較高的被測(cè)靈敏度及檢測(cè)可重復(fù)性。經(jīng)過(guò)t-檢驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)只有參與galactose metabolism通路的galactinol, melibiose和參與neuroactive ligand-receptor interaction通路的melatonin在甲狀腺乳頭狀癌組織和正常甲狀腺組織之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),可以作為診斷標(biāo)志物進(jìn)行后續(xù)研究。5.將galactinol, melibiose 和 melatonin作為聯(lián)合標(biāo)志物對(duì)于甲狀腺乳頭狀癌的診斷效率最高。我們構(gòu)建ROC曲線計(jì)算曲線下面積(AUC)以研究三個(gè)標(biāo)志物的診斷效果。首先,分別構(gòu)建三個(gè)標(biāo)志物的ROC曲線,發(fā)現(xiàn)無(wú)論是利用非靶標(biāo)的半定量數(shù)據(jù)還是靶標(biāo)實(shí)驗(yàn)的定量數(shù)據(jù),除galactinol以外,其他兩個(gè)指標(biāo)的AUC值均小于0.9。其次,我們將三個(gè)指標(biāo)聯(lián)合起來(lái)研究,基于非靶標(biāo)數(shù)據(jù)顯示聯(lián)合標(biāo)志物的診斷靈敏度為93.3%,特異性為100%,AUC值為0.95。通過(guò)分析靶標(biāo)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù),進(jìn)一步證明了聯(lián)合標(biāo)志物診斷的優(yōu)勢(shì)：靈敏度90.0%,特異性100%,AUC值0.96。6. Galactose metabolism通路參與甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程。為了分析與甲狀腺乳頭狀癌相關(guān)性最大的代謝通路,我們利用Metabo Analyst 2.0 (http://www.metaboanalyst.ca/Metabo Analyst/)分析差異代謝物,數(shù)據(jù)表明半乳糖代謝通路的影響值為0.1,即該代謝通路顯著影響乳頭狀癌的腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程。通過(guò)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中的半乳糖代謝通路圖,我們發(fā)現(xiàn)α-半乳糖苷酶(GLA)是影響半乳糖代謝的關(guān)鍵酶之一。同時(shí),我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明通路中的甘露糖(mannose), sorbitol, galactinol, melibiose 和 glucose均是GLA對(duì)半乳糖進(jìn)行分解得到的產(chǎn)物,且它們的含量在癌組織中均較低。因此,我們推測(cè)甲狀腺乳頭狀癌組織中GLA的活性降低或受到抑制可能是相關(guān)降解產(chǎn)物含量降低的原因,通過(guò)改變它的活性也可能成為甲狀腺乳頭狀癌后續(xù)治療研究中的有效靶點(diǎn)。結(jié)論：1.本次研究首次探索出非靶標(biāo)和靶標(biāo)代謝組學(xué)聯(lián)合研究甲狀腺乳頭狀癌輔助診斷標(biāo)志物的方法。這種篩選加驗(yàn)證的方法對(duì)標(biāo)志物進(jìn)行精確定性和定量分析,使篩選出的標(biāo)志物具有更高的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性,有效提高了其臨床應(yīng)用價(jià)值。這是首次將靶標(biāo)代謝組學(xué)的方法應(yīng)用于甲狀腺癌標(biāo)志物研究。2.本次研究創(chuàng)造性得探索出利用非靶標(biāo)GC-TOF-MS和靶標(biāo)GC-TOF-MS, UHPLC-QqQ-MS平臺(tái)對(duì)甲狀腺乳頭狀癌組織樣本進(jìn)行分析的具體實(shí)驗(yàn)方法。并且證明了GC-TOF-MS平臺(tái)可用于甲狀腺乳頭狀癌組織樣本和正常組織樣本的判別診斷。3.代謝物圖譜易受機(jī)體內(nèi)外多方面因素的影響,是代謝組學(xué)分析的特征之一,本次研究專(zhuān)門(mén)針對(duì)甲狀腺乳頭狀癌這一最常見(jiàn)甲狀腺癌病理學(xué)類(lèi)型進(jìn)行分析,可以排除由于病理類(lèi)型不同而對(duì)代謝圖譜造成的干擾。利用組織樣本進(jìn)行研究可以最直接得反映病灶本身代謝相關(guān)變化,為腫瘤形成機(jī)制的研究提供可靠線索。4.由于代謝系統(tǒng)的復(fù)雜性,我們特別提出利用聯(lián)合標(biāo)志物輔助甲狀腺乳頭狀癌診斷。通過(guò)我們的研究,galactinol,melibiose 和 melatonin三種代謝物作為聯(lián)合標(biāo)志物被提出來(lái)用于輔助診斷。5.代謝物富集分析得出的受影響的代謝通路的結(jié)果提示影響甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生發(fā)展的因素。Galactose metabolism通路作為人體能量代謝的一部分在甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。我們提出該通路中的關(guān)鍵酶的GLA可能作為新的治療靶點(diǎn)用于今后的研究。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R736.1
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本文編號(hào)：1602431