本文選題：胃癌發(fā)生　切入點(diǎn)：胃組織干細(xì)胞　出處：《中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：胃癌是最常見的惡性腫瘤之一。根據(jù)世界衛(wèi)生組織公布的統(tǒng)計(jì)報(bào)告顯示,2012年胃癌的發(fā)病率居各種惡性腫瘤的第5位,癌癥死亡率居第3位。近年來(lái)研究人員利用基因敲除技術(shù)揭示了多種分子在胃癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用。但是,由于之前研究所利用的胃癌小鼠模型是在全體細(xì)胞或者胃粘膜全層上皮細(xì)胞發(fā)生突變,無(wú)法明確胃癌發(fā)生的起始細(xì)胞究竟是哪種特定的細(xì)胞類型。所以,胃癌的細(xì)胞起源一直是該研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)科學(xué)問(wèn)題。理論上來(lái)說(shuō),組織干細(xì)胞由于其持續(xù)的自我更新和長(zhǎng)期存活的特性可能比分化成熟的細(xì)胞更易于成為腫瘤的起始細(xì)胞。但由于一直以來(lái)缺乏明確的分子標(biāo)志物,胃組織干細(xì)胞的異常是否能夠?qū)е挛赴┑陌l(fā)生缺乏直接的體內(nèi)證據(jù)。2010年研究報(bào)道了第一個(gè)胃竇及胃-食管(小鼠對(duì)應(yīng)的解剖結(jié)構(gòu)是腺胃-前胃/食管)交接處的干細(xì)胞標(biāo)記物L(fēng)gr5,但關(guān)于胃Lgr5~+組織干細(xì)胞在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用還存在著爭(zhēng)議。之前的研究表明,胃Lgr5~+干細(xì)胞的異常僅能導(dǎo)致微腺瘤或者良性的腺瘤,而不能導(dǎo)致惡性胃癌的發(fā)生。另外,一些臨床的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)胃癌樣本中存在Lgr5~+的腫瘤細(xì)胞或者Lgr5的高表達(dá),但也有一些臨床研究發(fā)現(xiàn)Lgr5~+細(xì)胞在胃癌早期缺如,進(jìn)一步質(zhì)疑了胃Lgr5~+組織干細(xì)胞在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用。所以,我們提出了以下的科學(xué)問(wèn)題:1)胃Lgr5~+干細(xì)胞是否是胃癌的細(xì)胞起源;2)胃Lgr5~+干細(xì)胞是否比分化細(xì)胞更容易起始胃癌發(fā)生;3)人胃癌樣本中LGR5的表達(dá)及信號(hào)通路的失調(diào)如何?為了解決以上的科學(xué)問(wèn)題,我們利用條件基因打靶技術(shù)在胃竇及胃-食管交接處的Lgr5~+干細(xì)胞中特異性地對(duì)TGF-β、Akt、Wnt和Kras等腫瘤相關(guān)重要信號(hào)通路的關(guān)鍵基因進(jìn)行誘導(dǎo)修飾,并結(jié)合體內(nèi)的細(xì)胞譜系示蹤技術(shù),考察Lgr5~+組織干細(xì)胞是否能夠作為胃癌的細(xì)胞起源,分析腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中干細(xì)胞自身的穩(wěn)態(tài)維持、動(dòng)員及其分化等的變化以及腫瘤中相關(guān)的分子和信號(hào)通路的改變,明確Lgr5~+組織干細(xì)胞在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用和機(jī)制。通過(guò)對(duì)三種分化成熟的細(xì)胞進(jìn)行相同的基因改變,進(jìn)一步分析胃Lgr5~+干細(xì)胞是否比分化細(xì)胞更容易起始胃癌的發(fā)生。最后結(jié)合TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中大規(guī)模的人胃癌樣本進(jìn)行分析,進(jìn)一步明確胃組織干細(xì)胞是否與人胃癌的發(fā)生和進(jìn)展相關(guān)。胃竇Lgr5~+干細(xì)胞中特異性地敲除Smad4和PTEN導(dǎo)致65%(13/20)的小鼠在誘導(dǎo)后三個(gè)月內(nèi)發(fā)生腺瘤,40%(8/20)發(fā)生浸潤(rùn)性的腸型腺癌。腫瘤細(xì)胞增殖旺盛且失去了分化成熟的能力。進(jìn)一步分析腫瘤發(fā)生相關(guān)信號(hào)通路的改變,我們發(fā)現(xiàn)Smad4下游靶分子中與增殖密切相關(guān)的cyclin D1以及與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的Spp1的表達(dá)明顯升高,與增殖轉(zhuǎn)移相關(guān)的MAPK、EGFR、Stat3等信號(hào)通路異常激活。接下來(lái)我們考察Smad4和PTEN的缺失對(duì)胃竇干細(xì)胞及其子代細(xì)胞的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)雙基因的缺失不影響胃竇Lgr5~+干細(xì)胞的數(shù)目,但導(dǎo)致前體細(xì)胞增多并抑制其向子代細(xì)胞的分化,提示來(lái)自突變的Lgr5~+干細(xì)胞的增殖細(xì)胞主要貢獻(xiàn)了腫瘤早期的細(xì)胞構(gòu)成。在胃癌進(jìn)展過(guò)程中,我們發(fā)現(xiàn)在腺瘤以及腺癌的粘膜區(qū)Lgr5的表達(dá)依然位于底部,這與正常胃竇中Lgr5的表達(dá)譜相似。令人驚訝的是,在腺癌的浸潤(rùn)區(qū)Lgr5~+腫瘤細(xì)胞廣泛散在性分布、增殖旺盛并高表達(dá)腫瘤干細(xì)胞的分子標(biāo)記物CD44,提示我們Lgr5~+細(xì)胞可能促進(jìn)胃癌的惡性轉(zhuǎn)化以及浸潤(rùn)。另外在胃-食管交接處的Lgr5~+干細(xì)胞中敲除Smad4和PTEN也能夠?qū)е?5%的小鼠發(fā)生浸潤(rùn)性的腺癌。此外,胃竇Lgr5~+干細(xì)胞中敲除Smad4和p53的同時(shí)激活Kras也能夠?qū)е滦∈蟀l(fā)生腺瘤。這些結(jié)果證明突變的Lgr5~+干細(xì)胞能夠起始胃癌的發(fā)生。接下來(lái),我們考察胃Lgr5~+干細(xì)胞是否比分化細(xì)胞更容易起始胃癌的發(fā)生。我們選取了兩種由Lgr5~+干細(xì)胞分化而來(lái)的細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在胃竇的頂細(xì)胞及胃體胃竇轉(zhuǎn)換區(qū)的壁細(xì)胞中特異性地敲除Smad4和PTEN,在同樣的時(shí)間內(nèi)都不能導(dǎo)致胃癌的發(fā)生。另外胃體小彎處存在著一群Lgr5標(biāo)記的分化成熟的主細(xì)胞,相同的遺傳背景條件下Lgr5~+的主細(xì)胞同樣不能起始胃癌的發(fā)生,證明胃Lgr5~+干細(xì)胞比分化成熟的細(xì)胞更容易起始胃癌的發(fā)生。最后,我們結(jié)合TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中大規(guī)模的人胃癌樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)LGR5在胃竇以及胃-食管交接處的腸型胃癌中的表達(dá)均明顯升高。此外,56%(61/109)的人腸型胃癌樣本中SMAD4出現(xiàn)缺失和突變,33%(36/109)的人腸型胃癌樣本中PTEN出現(xiàn)缺失和突變。SMAD4和PTEN基因的缺失直接導(dǎo)致了其RNA和蛋白表達(dá)的下降,并進(jìn)一步導(dǎo)致了SMAD4和PTEN下游信號(hào)通路的失調(diào)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)SMAD4和PTEN在基因上的缺失更傾向于同時(shí)發(fā)生,而且導(dǎo)致了其RNA表達(dá)的協(xié)同下降,提示SMAD4和PTEN可能能夠協(xié)同抑制人類胃癌的發(fā)生發(fā)展。這些結(jié)果都表明,人胃癌樣本常伴L(zhǎng)GR5的高表達(dá)以及SMAD4和PTEN信號(hào)通路的失調(diào),與我們小鼠中得到的結(jié)果相一致,進(jìn)一步提示人類中LGR5+干細(xì)胞中缺失SMAD4和PTEN也可能導(dǎo)致胃癌的發(fā)生。綜上所述,本課題結(jié)論及原創(chuàng)性主要包括以下三點(diǎn):1)證實(shí)胃Lgr5~+干細(xì)胞是浸潤(rùn)性腸型胃癌的細(xì)胞起源。我們利用條件基因打靶技術(shù)在小鼠成體胃竇和胃-食管交接處的Lgr5~+干細(xì)胞中特異性敲除Smad4和PTEN,在誘導(dǎo)3個(gè)月內(nèi)小鼠逐步發(fā)生微腺瘤、腺瘤以及浸潤(rùn)性腺癌。2)證實(shí)了胃Lgr5~+干細(xì)胞比分化細(xì)胞更容易起始胃癌的發(fā)生;3)在大規(guī)模的人胃癌樣本中發(fā)現(xiàn)LGR5的高表達(dá),而且常伴SMAD4和PTEN基因的協(xié)同缺失及其下游信號(hào)通路的失調(diào)。本研究為理解人類胃癌發(fā)生的細(xì)胞學(xué)機(jī)制及分子機(jī)制提供了新的認(rèn)識(shí)。此外,Lgr5~+干細(xì)胞不僅作為胃癌的起始細(xì)胞,還可能參與胃癌進(jìn)展,這為胃癌的臨床診斷以及細(xì)胞靶向治療提供了新的理論基礎(chǔ)和可能性。
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【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.2

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本文編號(hào)：1601586