本文選題：乳腺癌　切入點：Foxp3　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：乳腺癌是最常見的惡性腫瘤之一,近年來以來,乳腺癌的發(fā)病率一直呈上升趨勢,全球每年約有100萬婦女被診斷為乳腺癌,近年以來,我國乳腺癌的發(fā)病率快速上升,已經(jīng)成為我國女性發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致乳腺癌患者死亡的主要原因之一,在臨床診斷時,約有10%的患者已經(jīng)發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移,一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移,預(yù)后較差,5年生存率僅為20%。因此,深入研究與乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的信號通路,明確通路中的受體和效應(yīng)分子之間的調(diào)控方式和特點,對于闡明乳腺癌轉(zhuǎn)移的機制意義重大。叉狀頭轉(zhuǎn)錄因子Foxp3作為乳腺癌的抑制基因,近年來受到越來越多的關(guān)注。研究表明,在正常乳腺上皮細(xì)胞中存在Foxp3的表達(dá),而在乳腺癌組織中,Foxp3低表達(dá)甚至缺失;Foxp3在乳腺癌中表達(dá)水平的下降導(dǎo)致了多種乳腺癌相關(guān)癌基因的表達(dá)調(diào)控異常,進而促進了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展;Foxp3基因突變的小鼠患乳腺腫瘤的幾率明顯增高,且對致癌物質(zhì)的敏感性增加;進一步的實驗證明,Foxp3可以通過抑制癌基因HER-2/Erb B2,SKP2的表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖。因此,Foxp3是乳腺癌發(fā)生發(fā)展的重要的抑制基因,其功能及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的闡明將為乳腺癌的發(fā)生發(fā)展提供重要的線索,為乳腺癌的治療提供新的方法。盡管大量的研究表明Foxp3能夠抑制乳腺癌的增殖,然而對于Foxp3在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的功能卻鮮有報道。Overbeck-Zu等研究發(fā)現(xiàn),在乳腺癌中Foxp3的低表達(dá)會促進腫瘤細(xì)胞趨化因子驅(qū)動的轉(zhuǎn)移,提示Foxp3可能會抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移,但機制尚不清楚,仍有很多問題有待深入探討:1、在乳腺癌臨床標(biāo)本中,Foxp3表達(dá)水平的變化與乳腺癌的轉(zhuǎn)移有無相關(guān)性?2、作為轉(zhuǎn)錄因子,Foxp3在乳腺癌細(xì)胞中可以調(diào)控那些轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)?3、Foxp3調(diào)控這些分子表達(dá)的機制是怎樣的呢?4、上調(diào)Foxp3表達(dá)后,能否抑制乳腺癌動物模型中腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移?上述問題的回答有助于闡明Foxp3抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移的機制,將豐富Foxp3作為乳腺癌抑制基因的功能。為此,我們進行了下列研究工作:①首先利用組織芯片技術(shù),分析221例乳腺癌臨床標(biāo)本中Foxp3的表達(dá)水平,統(tǒng)計了其在正常乳腺組織及不同臨床分期的乳腺癌中的表達(dá)水平的差異,從而鑒定Foxp3的表達(dá)水平與乳腺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系。②其次,為了確認(rèn)Foxp3通過對哪些分子表達(dá)的調(diào)控從而參與了乳腺癌的轉(zhuǎn)移,我們還通過免疫組織化學(xué)、實時定量PCR、Western Blot分析了乳腺癌臨床標(biāo)本及乳腺癌細(xì)胞株中Foxp3與細(xì)胞黏附分子CD44表達(dá)水平之間的關(guān)系。③繼而,為了驗證Foxp3能否抑制乳腺癌中CD44的表達(dá),我們選用兩株低表達(dá)Foxp3的細(xì)胞系SKBr-3、MDA-MB-231,瞬時轉(zhuǎn)染Foxp3;選用兩株高表達(dá)Foxp3的細(xì)胞系MCF-7、T47D,采用si RNA技術(shù)干涉掉內(nèi)源的Foxp3,利用Western Blot,實時定量PCR觀察CD44表達(dá)水平的改變。④為了觀察Foxp3和CD44在細(xì)胞水平表達(dá)的相關(guān)性,采用流式分析技術(shù),分別收集高表達(dá)/低表達(dá)CD44的MDA-MB-231細(xì)胞亞群,運用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)分析兩個不同細(xì)胞亞群中Foxp3的表達(dá)水平。⑤運用了雙熒光素酶報告基因、染色質(zhì)免疫沉淀分析(CHIP)和電泳遷移率實驗(EMSA)來闡明Foxp3調(diào)控CD44表達(dá)的機制。⑥利用Transwell和細(xì)胞黏附實驗明確Foxp3能否通過調(diào)控CD44的表達(dá)來影響乳腺癌細(xì)胞的黏附和侵襲能力。⑦最后,利用動物活體成像技術(shù)證實在體內(nèi)環(huán)境中Foxp3能否抑制乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移。通過以上實驗我們得到了下列結(jié)果:①通過組織芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn),與正常乳腺組織相比,Foxp3在已發(fā)生轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中的表達(dá)量顯著下降,這說明Foxp3與乳腺癌的轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系。Foxp3在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)水平的降低或者缺失可能是導(dǎo)致乳腺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要原因。②應(yīng)用SPSS 13.0軟件分析發(fā)現(xiàn),CD44和Foxp3的表達(dá)水平在乳腺癌組織中呈負(fù)相關(guān),提示兩者之間的關(guān)系密切,Foxp3可能是CD44表達(dá)的抑制基因。③通過上調(diào)乳腺癌細(xì)胞中Foxp3的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)CD44的表達(dá)水平隨之降低;而當(dāng)干涉掉Foxp3后,則能促進CD44的表達(dá)。從而明確了在乳腺癌細(xì)胞中Foxp3能夠調(diào)控CD44的表達(dá)。④細(xì)胞免疫熒光實驗明確了Foxp3和CD44蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布與定位,并進一步證實了CD44的表達(dá)受到了Foxp3的調(diào)控。⑤運用流式細(xì)胞分選技術(shù)證實在MDA-MB-231細(xì)胞中,高表達(dá)CD44細(xì)胞亞群的Foxp3表達(dá)水平低于低表達(dá)CD44的細(xì)胞亞群。⑥通過雙熒光素酶報告基因技術(shù)證實了Foxp3能夠影響CD44啟動子的活性;并通過構(gòu)建啟動子截短體的方法明確了Foxp3在CD44啟動子上的核心調(diào)控區(qū)。⑦CHIP實驗證實在細(xì)胞內(nèi)Foxp3能夠同CD44的啟動子結(jié)合。⑧EMSA實驗進一步明確了Foxp3與CD44啟動子的結(jié)合作用。⑨通過尾靜脈注射方法建立裸鼠的乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型,運用動物活體成像技術(shù)證實過表達(dá)Foxp3能夠抑制乳腺癌在體內(nèi)的肺轉(zhuǎn)移。在本研究中,我們首次證實了Foxp3能夠通過調(diào)控CD44啟動子的轉(zhuǎn)錄活性,進而抑制CD44在乳腺癌中的表達(dá),在乳腺癌的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用。該研究結(jié)果完善和補充了Foxp3作為乳腺癌抑制基因的的功能,同時明確了CD44在乳腺癌中過表達(dá)的分子機制,為進一步闡明乳腺癌的轉(zhuǎn)移機制提供了新的思路,為乳腺癌的臨床治療提供了新的靶點和方法。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.9
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本文編號：1601533