本文選題：HPV58　切入點：E6　出處：《浙江大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：在世界范圍內(nèi),宮頸癌是女性第二大常見的惡性腫瘤,每年有527,624個新發(fā)病例和265,653個死亡病例(www.hpvcentre.net in Oct 31th,2014),其中85%的宮頸癌發(fā)生在發(fā)展中國家。宮頸癌病因明確,大量的研究表明高危型人乳頭瘤病毒(HPV)持續(xù)感染是宮頸癌及癌前病變的主要致病因素。HPV分高危型和低危型,高危型包括：HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV51、HPV52、 HPV56、HPV58、HPV61等。研究表明,HR-HPV表達(dá)的病毒癌基因E6和E7,可分別結(jié)合降解宿主細(xì)胞P53和Rb,引起細(xì)胞周期、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為改變,促進(jìn)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化,最終導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生與進(jìn)展。但對不同型別的病毒癌蛋白之間是否存在差異尚不清楚。流行病學(xué)證據(jù)顯示,各種型別HPV在細(xì)胞學(xué)正常婦女和不同宮頸病變患者中的感染頻率并不相同,反應(yīng)了不同型別病毒感染力和致病力的不同,但是否與宿主對HPV型別特異的易感性有關(guān)所知甚少。本研究從不同型別HPV致宮頸癌能力差異和不同型別HPV感染宿主是否與宿主易感性有關(guān)兩方面進(jìn)行研究,首先通過設(shè)計兩條HPV58 E6特異性多肽片斷,將多肽交聯(lián)至三種不同載體蛋白,免疫兔子,獲得特異性HPV58 E6兔單克隆抗體。其次,通過構(gòu)建pFLAG-CMV5.1-HPV58E6/E7和pFLAG-CMV5.1-HPV16 E6/E7真核生物表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染293T和U20S細(xì)胞,觀察HPV58E6/E7和HPV16 E6/E7基因?qū)?xì)胞的周期、凋亡、侵襲能力的差異及下游分子的表達(dá)差異,比較兩者致癌能力的差異。最后,收集3299例宮頸脫落細(xì)胞樣本,選出875例單純HPV16,18,52,58陽性和HPV陰性,提取DNA,通過Illumina BeadXpress VeraCode platformSNP分型檢測技術(shù),對HPV感染相關(guān)受體基因(EGFR, PPIB, HSPG2, FGFR2, FURIN, ITGA6, TSPAN1和SDC2)上的96個tagSNP位點進(jìn)行檢測,分析目的基因SNP與型別特異HPV感染和官頸病變進(jìn)展的相關(guān)性。本研究首次成功獲得了HPV58E6單克隆抗體；在體外實驗中驗證了相比HPV58E6/E7, HPV16E6/E7具有更強的促細(xì)胞周期進(jìn)程、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞侵襲的能力,進(jìn)一步揭示了E6-P53和E7-pRB在HPV致癌過程中所起的關(guān)鍵作用；還發(fā)現(xiàn)了與HPV型別特異性感染及其致宮頸病變進(jìn)展相關(guān)的差異宿主SNP位點,基因型及單倍型。本研究初步闡述了HPV在自然界的分布規(guī)律和不同病變中分布特征的相關(guān)機制,更好地了解了HPV的致癌中的型別特異性差異,為制定有針對性的宮頸癌防控策略提供了科學(xué)證據(jù)。第一部分 HPV58E6兔單克隆抗體的制備目的：研發(fā)HPV58E6特異性兔單克隆抗體,為進(jìn)一步體外研究HPV58E6提供基礎(chǔ)。方法：通過將HPV58E6序列與HPV16E6,HPV31E6,HPV33E6,HPV52E6,HPV67E6等同源性較高的序列進(jìn)行比對,找出HPV58E6的特異性序列,針對該特異性序列設(shè)計兩條HPV58E6多肽片斷,將其交聯(lián)至三種不同載體蛋白,免疫新西蘭大白兔,獲得免疫血清,取血清篩選出抗體陽性的大白兔并做ELISA確定滴度,分離篩選出的大白兔脾細(xì)胞并與融合伴侶細(xì)胞240E-W2進(jìn)行細(xì)胞融合,之后鋪板到96孔培養(yǎng)板,在1640AB培養(yǎng)基中進(jìn)行克隆培養(yǎng),對細(xì)胞上清進(jìn)行ELISA篩選,找到表達(dá)HPV58E6特異性抗體的陽性細(xì)胞克隆,針對陽性克隆,提取細(xì)胞RNA,用引物F1/R1進(jìn)行RT-PCR擴增,得到多個重鏈cDNA和多個輕鏈cDNA;將cDNA分別構(gòu)建到pTT5質(zhì)粒表達(dá)載體中,將包含重鏈cDNA的pTT5質(zhì)粒與包含輕鏈cDNA的pTT5質(zhì)粒進(jìn)行兩兩配對,共轉(zhuǎn)染到HEK-293-6E細(xì)胞后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；取細(xì)胞培養(yǎng)的上清液,進(jìn)行ELISA檢測；篩選IgG濃度最高且滴度OD值大于0.3的配對,即為HPV58E6特異性兔單克隆抗體的重鏈和輕鏈配對。制備重組抗體并進(jìn)行測序分析,從而獲得特異性HPV58E6兔單克隆抗體。結(jié)果：1.設(shè)計的特異性HPV58E6多肽片段免疫新西蘭大白兔后獲得的血清能夠結(jié)合pEGFP-C1-HPV58E6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞所提取的蛋白。2.雜交瘤細(xì)胞上清在pEGFP-C1-HPV16E6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組未見條帶,而在pEGFP-C1-HPV58E6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組可見條帶。3.重組抗體ZJM1B-9在pEGFP-C1-HPV16E6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組未見條帶,而在pEGFP-C1-HPV58E6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組可見條帶。結(jié)論：1.采用雜交瘤技術(shù)可以成功獲得抗HPV58E6兔單克隆抗體。2.獲得的抗HPV58E6兔單克隆抗體可以特異性結(jié)合HPV58E6蛋白,而不能結(jié)合HPV16E6蛋白。第二部分：HPV58與HPV16 E6/E7致官頸癌功能差異的研究目的：明確HPV16與HPV58癌基因E6/E7在細(xì)胞表型方面的差異,及E6-P53和E7-pRB的表達(dá)和定位的區(qū)別,從細(xì)胞表型和分子水平闡述兩種病毒致癌能力的差異。方法：通過構(gòu)建pFLAG-CMV5.1-HPV58E6/E7和pFLAG-CMV5.1-HPV16E6/E7真核生物表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染293T和U20S細(xì)胞,通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和凋亡,CCK8檢測細(xì)胞增殖能力,Transwell檢測細(xì)胞侵襲能力,免疫熒光共聚焦拍攝細(xì)胞E6-P53和E7-pRB的共表達(dá)和共定位,比較HPV58E6/E7和HPV16E6/E7基因?qū)?xì)胞周期、凋亡、侵襲能力的差異及下游分子的表達(dá)差異。結(jié)果：1.在293T和U20S細(xì)胞中,相比陰性對照組,HPV58E6/E7過表達(dá)能促進(jìn)細(xì)胞增殖；相比]HPV58E6/E7, HPV16E6/E7過表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖能力更強。2.在293T細(xì)胞中,HPV58E6/E7組細(xì)胞周期S期比例分別為42.68%和45.39%,而HPV16E6/E7組細(xì)胞周期S期比例分別52.66%和49.18%。在U20S細(xì)胞中,]HPV58E6/E7組細(xì)胞周期S期比例分別為32.73%和27.03%,而HPV16E6/E7組細(xì)胞周期S期比例分別37.32%和36.24%。3.在293T細(xì)胞中,]HPV58E6/E7組細(xì)胞早期凋亡比例分別為9.66%和12.1%,而HPV16E6/E7組細(xì)胞早期凋亡比例分別為6.6%和14.0%。在U20S細(xì)胞中,HPV58E6/E7組細(xì)胞早期凋亡比例分別為5.63%和5.22%,而HPV16E6/E7組細(xì)胞早期凋亡比例分別為3.84和3.44%。4.在293T和U20S細(xì)胞中,相比陰性對照組,HPV58E6/E7組細(xì)胞侵襲能力增強；相比HPV58E6/E7, HPV16E6/E7組細(xì)胞侵襲能力更強。5.在293T和U20S細(xì)胞中,相比HPV58E6組,HPV16E6組P53下降更顯著,且胞核內(nèi)表達(dá)更低；同時相比HPV58 E7組,HPV16E7組pRB表達(dá)增多,且在核內(nèi)表達(dá)更多。結(jié)論：與HPV58 E6/E7相比,HPV16 E6/E7顯示了更強的促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞侵襲能力和降解P53和pRB能力,提示HPV16比HPV58具有更強的致癌力。第三部分：HPV相關(guān)受體基因變異與型別特異官頸感染和病變進(jìn)展的相關(guān)性研究目的：明確不同個體之間的HPV感染相關(guān)受體是否存在型別特異的與宮頸感染和病變進(jìn)展的相關(guān)的單核甘酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNPs).方法：在3299例宮頸脫落細(xì)胞樣本中,挑選出單一HPV16,18,52,58陽性和HPV陰性,共875例,提取DNA,通過Illumina BeadXpress VeraCode platform SNP分型檢測技術(shù),對HPV感染相關(guān)受體基因(EGFR, PPIB, HSPG2, FGFR2, FURIN, ITGA6, TSPAN1和SDC2)上的96個tagSNP位點進(jìn)行檢測,分析目的基因SNP與型別特異HPV感染和官頸病變進(jìn)展的相關(guān)性。在對照組中檢驗Hardy-Weinberg平衡。運用Haploview, SPSS16.0, PLINK等軟件分析SNP結(jié)果。結(jié)果：對病毒型別特異性感染的易感性分析顯示,HPV16有2個SNP(rs28384376, rs12034979)顯著相關(guān)和3個單倍型("GGAA", "GGGG"和“GA”)臨界相關(guān),HPV18有4個SNP(rs2575738, rs6697265, rs2575712, rs2575735)和3個單倍型(“GGG”,“GGA”和"GGAGA")顯著相關(guān),HPV52有2個SNP (rs10510097, rs12718946)和2個單倍型("GGGAA"和“GGA”)顯著相關(guān),HPV58有3個SNP (rs4947972, rs2981451, rs2575735)和2個單倍型(“GC”和“GA”)顯著相關(guān)。對病毒型別特異性宮頸病變進(jìn)展的易感性分析顯示,HPV16有5個SNP(rs3135772, rs2556537, rs12034979, rs1047057, rs16894821)和1個單倍型(“GG”)顯著相關(guān),HPV18有3個SNP (rs6697265, rs6680566, rs16860426)和1個單倍型(“GG”)顯著相關(guān),HPV52有3個SNP (rs878949, rs12718946, rs12668175)和1個單倍型(“CAA”)顯著相關(guān),HPV58未見有顯著相關(guān)的SNP位點和單倍型。結(jié)論：宿主HPV感染相關(guān)受體不同的基因變異呈現(xiàn)了不同的病毒型別特異感染和病變進(jìn)展的易感性,可能在宮頸癌篩查中有潛在的應(yīng)用價值。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.33

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本文編號：1590040